Product

Stellaris® RNA FISH プローブ

複合領域・汎用

Stellaris ®  RNA FISH プローブ

細胞・組織のRNA局在の観察や遺伝子発現の定量等に。

LGC Biosearch社製 Stellaris® RNA FISHプローブは、細胞・組織のRNA局在の観察や遺伝子発現の定量等に用いることができるRNA FISH用プローブセットです。

様々な生物種の遺伝子・RNAに関するプローブセットを取り揃えています。

※Stellaris® RNA FISHプローブは、米国 ラトガース大学(ニュージャージー州立総合研究大学)からライセンス供与され、販売されています。
研究用途のみ使用可能です。

特⻑

  • RNA1分⼦に対し、最⼤48種類のプローブを
    セットにしています。
  • マルチプレックス検出も可能です。
  • 一般的に使用される蛍光色素の代替となる、
    オリジナルの蛍光色素を使用しています。
    ※プローブ種類ごとに対応する蛍光色素標識が
       異なります。

HER2 mRNA
緑:HER2 mRNA (Stellaris)
⾚:HER2 タンパク質 (免疫蛍光染⾊)

Stellaris RNA FISHプローブで使用される蛍光色素一覧

蛍光色素 代替可能な色素 励起(nm)/蛍光(nm)

FAM FITC 495/520

CAL Fluor® Orange 560* mKO/mOrange 538/559

Quasar® 570* Cy3 548/566

TAMRA TRITC 557/583

CAL Fluor® Red 590* TAMRA 569/591

CAL Fluor® Red 610* mCherry/TEXAS RED 590/610

CAL Fluor® Red 635*
618/637

Quasar® 670* Cy5 647/670
*LGC Biosearch社オリジナル蛍光色素


Stellaris RNA FISHの手順

Stellaris RNA FISHの手順

  
  (3分26秒、英語)

  Mechanism
  
  (48秒、英語)

ページの先頭に戻る

製品ラインナップ



プローブについてのご不明点・価格等、お気軽にお問合せくださいませ。(受付時間:平日 9:00 - 17:00)

  電話:03-3816-0851       E-mail:reagents@primetech.co.jp


  Design Ready プローブセット(メーカー設計済プローブ)

様々な生物種のRNAの検出・定量のために、あらかじめ設計済みのRNA FISH用プローブセットです。
対象となる生物種・RNA・蛍光色素を組み合わせた約4500種類の製品の中からご選択いただけます。


  • Design Ready・Ship Ready全種類をご確認されたい場合は、
     こちらよりExcelファイルをダウンロード・ご利用下さい。   Excelファイルのダウンロード (2018/5月現在)
   型式詳細検索はこちらから



  • 容量:5nmol (200〜400ハイブリダイゼーション、使⽤濃度に依存)
  • 対応する蛍光⾊素: CAL Fluor Orange 560 *、CAL Fluor Red 590 *、CAL Fluor Red 610 *、
    CAL Fluor Red 635 *、FAM、Quasar 570 *、Quasar 670 * *LGC Biosearch社オリジナル蛍光⾊素
  • 出荷形態・温度:凍結乾燥(室温管理)
  • 保存温度条件:[冷蔵:2~8℃]1ヵ月、[冷凍:-15~-30℃ 暗所]1ヵ月以上
    ※凍結融解回数は極力少なくしてください。
  • 納期:ご注文から2週間程度


製品ラインナップ例
がん遺伝子プローブセット
ADAM17 EGFR HOTAIR MYC
AKT1 ERBB2&3 HOXA5 NCOA3
AR ERG JAG1 PCA3
BCL2 EZH2 JUN PIK3CA
BRAF FOS KIT MTOR
BRCA1&2 GREB1 KLK3 TERT
CDK4 H19 MALAT1 TERC
CINNB1 HIF1A MKI67 TP53

神経関連遺伝子プローブセット
ATRX Gfap NF1 SAT1
Cx3cr1 Itpr2 NOG SETD2
DCX Map2 OLIG2 Rbfox3
DHPS MTFT MIAT Sox2
DOHH Necab1&2 PMP22 STUB1
FOS NEFL Pnoc Tac1
Foxp2 NES Pou5f1 Tbr1
GAD1&2 Neurog1 PROX1 UCP2

Long Non-Coding RNA プローブセット
FALEC H19 HOTAIR KCNQ1OT1
MALAT1 NEAT1 5’segment NEAT1 middle segment NRON
PANDAR PCA3 PRNCR1 PVT1
SCHLAP1 TUG1 UCA1 XIST

幹細胞研究プローブセット例
BCL2 GFAP CDKN1A NANOG
KIT NES NOTCH1 POU5F1
TERT SOX2 XIST H19
NEAT1 HOTAIR
この他にもマウス、ラット、イヌ、サル、トリ、ゼブラフィッシュ、カエル、ショウジョウバエ、線虫、
酵⺟、⼤腸菌等、22種の生物種のDesign Ready プローブセットを多数取り揃えています。

▲ ラインナップリストへ戻る

  カスタムプローブセット (設計済プローブが見つからない場合)

Design Readyプローブセットに希望されるものがない場合、各生物種のカスタムプローブセットをご提供することも 可能です。

  • 容量:5nmol (200〜400ハイブリダイゼーション、使⽤濃度に依存)
  • 対応する蛍光⾊素: CAL Fluor Orange 560 *、CAL Fluor Red 590 *、CAL Fluor Red 610 *、
    CAL Fluor Red 635 *、FAM、Quasar 570 *、Quasar 670 * *LGC Biosearch社オリジナル蛍光⾊素
  • 出荷形態・温度:凍結乾燥(室温管理)
  • 保存温度条件:[冷蔵:2~8℃]1ヵ月、[冷凍:-15~-30℃ 暗所]1ヵ月以上
    ※凍結融解回数は極力少なくしてください。
  • 納期:ご注文から2週間程度


   カスタムプローブセットのご注文時手順

   1. 必要情報のご提出   プローブ作成に必要な情報を  Excelフォーム にご入力いただき、
電子メールにてreagents@primetech.co.jpまでお送りください。
  
        
   2. プローブの設計   Excelシートの記載内容をもとに、弊社でBiosearch社のデザイナーを用いてプローブを設計します。
  
        
   3. 設計内容のご確認   設計内容をまとめた資料を、プライムテックよりお客様にご提示致します。内容をご確認いただきます。(複数のプローブ設計候補からお選びいただく場合もございます)
  
        
   4. ご注文   ご注文の確定

  

▲ ラインナップリストへ戻る

  Ship Ready プローブセット (コントロールプローブとして使用)

基礎遺伝子、Long noncoding RNA用のコントロール・プローブセットです。

  • 容量:1nmol (約80ハイブリダイゼーション)
  • Quasar 570 *または Quasar 670 *で標識
        Quasar 570 spectra         Quasar 670 spectra 

    *Quasar 570はCy3の、Quasar 670はCy5の代替となります。
    *いずれもLGC Biosearch社オリジナル蛍光⾊素です。 

  • 出荷形態・温度:凍結乾燥(室温管理)
  • 保存温度条件:[冷蔵:2~8℃]1ヵ月、[冷凍:-15~-30℃ 暗所]1ヵ月以上
    ※凍結融解回数は極力少なくしてください。
  • 納期:ご注文から2週間程度


基礎遺伝⼦
種類 Quasar 570      Quasar 670     
Human
Human GAPDH SMF-2026-1  SMF-2019-1
Human TFRC SMF-2006-1 -
Human POLR2A SMF-2003-1 -
Mouse
Mouse Gapdh SMF-3002-1 SMF-3140-1
Mouse Tfrc SMF-3007-1 -
Mouse Polr2a SMF-3005-1 -
Drosophila
Drosophila Gapdh SMF-5010-1 SMF-5011-1
Drosophila Rpll215 SMF-5008-1 SMF-5009-1
Nematode
Nematode AMA-1 SMF-6011-1 -
Yeast
Yeast PRO21 SMF-9072-1 -
Yeast TDH1_2_3 SMF-9074-1 -
※各蛍光色素の列の下に記載している記号は、型式です。
   該当のものがない場合は、「-」となっています。
※型式の右側にアイコンがあるものについては、アイコンをクリックすると、
   PRODUCT INFORMATION SHEET(英語)を開くことができます。

Long noncoding RNA
種類 Quasar 570      Quasar 670     
Human
Human MALAT1 SMF-2035-1 SMF-2046-1
Human NEAT1 5ʼ Segment SMF-2036-1 -
Human NEAT1 Middle Segment SMF-2037-1 -
Human XIST SMF-2038-1 -
Mouse
Mouse Malat1 SMF-3008-1 -
Mouse Neat1 5' Segment SMF-3009-1 -
Mouse Neat1 Middle Segment SMF-3010-1 -
Mouse Xist SMF-3011-1 -
※各蛍光色素の列の下に記載している記号は、型式です。
    該当のものがない場合は、「-」となっています。
※型式の右側にアイコンがあるものについては、アイコンをクリックすると、
   PRODUCT INFORMATION SHEET(英語)を開くことができます。

▲ ラインナップリストへ戻る

   Stellaris RNA FISH バッファー

Stellaris RNA FISHプローブを用いて細胞や組織上のRNA FISHを行う際に、最適なバッファーです。
検出を増強する独自の添加物が含まれており、特に顕著なバックグラウンド蛍光を示すアッセイに適しています。
  • Hybridization Buffer (10mL)
    約50~100回分
  • Wash Buffer A (60 mL)
    約50~100回分
  • Wash Buffer B (20 mL)
    約50~100回分

Stellaris RNA FISHバッファーと従来のRNA FISHバッファーの比較。ヒト細胞のPOLR2A (RNAポリメラーゼⅡサブユニットA)を、ヒトPOLR2Aプローブ (Cat# VSMF-2293-5) を用いて検出。
(左) Stellaris RNA FISHバッファー使用、 (右) 従来のRNA FISHバッファーを調製して使用。

型式 商品名 輸送温度条件 保存温度条件
SMF-HB1-10 Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer (10mL) 常温 冷蔵:2~8℃
SMF-WA1-60 Stellaris RNA FISH Wash Buffer A (60mL) 常温 室温
SMF-WB1-20 Stellaris RNA FISH Wash Buffer B (20mL) 常温 室温
※貯蔵寿命:3年間

▲ ラインナップリストへ戻る

ページの先頭に戻る

アプリケーション

  • 細胞・組織のmRNA局在観察
  • 遺伝⼦発現の定量
  • Long noncoding RNA (Lnc RNA) の局在観察
  • 感染症・ウイルス 等


がん研究

Stellaris RNA FISHと免疫蛍光アッセイのマルチプレックス画像。
ヒト腺癌細胞(SK-BR-3)のERBB2mRNA(緑)、ERBB2(HER2)タンパク質(マゼンタ)、DNA(赤)

神経科学研究

マウス凍結脳組織のアストロサイトにおけるGfap mRNAの局在
(赤、Cal Fluor Red 610標識)



Long Non-Coding RNAの検出

ヒトMCF7細胞におけるXIST lncRNAの局在

全組織標本
C.elegans elt-2 mRNAの局在



感染症・ウイルス研究

Guaico Culex virus (GCXV)
vRNA Segment 3 (緑)
vRNA Segment 4 (赤)
vRNA Segment 5 (青)
Courtesy of Michael Lindquist

これまでにStellaris RNA FISHプローブを用いて論文発表されたウイルス

Zika
Influenza
HIV
Ebola
Epstein-Barr
Hepatitis C
Rift Valley Fever
Rhinovirus
Guaico Culex virus
Coxsackievirus A10
Infectious Bronchitis Coronavirus
Orsay
Venezuelan Equine Encephalitis Virus
Porcine reproductive and respiratory syndrome virus
Tilapia lake virus (TiLV)
SIV
Sendai virus (SeV)

※Zikaウイルス以外はカスタムプローブセットを作製いただく必要がございます。


   Webinar: Detection of Long Noncoding RNAs by Stellaris FISH Probes   
  (35分22秒、英語、July 2012)

   Multiplexing Stellaris RNA FISH with Immunofluorescence   
  (6分57秒、英語、Nov. 2012)

ページの先頭に戻る

Image Galleries

LGC Biosearch Technologies社 Image Galleriesサイトへのリンクです。新しいタブで画面が開きます。



ページの先頭に戻る

論文実績数

Stellaris RNA FISHプローブを⽤いた577報の論⽂が発表されています。 このうち3割以上 (196報)がNature、Science、Cellの論⽂です (2017年3⽉時点) 。 論文実績数
Stellaris® RNA FISH Citation Centerへのリンク(LGC Biosearch Technologies社 Webサイト)

ページの先頭に戻る

References

【がん】
G1/S Inhibitors and t he SWI/SNF C omplex C ontrol Cell-Cycle E xit during M uscle Differentiation.
Ruijtenberg et al. Cell. 2015. url: https://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.06.013

Genome-wide profiling of p53-regulated enhancer RNAs uncovers a subset of enhancers controlled by a lncRNA.
Leveille et al. Nature Communications. 2015. url: https://dx.doi.org/10.1038/ncomms7520

Niche appropriation by Drosophila intestinal stem cell tumours.
Patel et al. Nature Cell Biology. 2015. url: https://dx.doi.org/10.1038/ncb3214

【神経科学】
Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution.
Emily Sylwestrak et al. Cell. 2016. url: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.038

Deficiency of the Survival of Motor Neuron Protein Impairs mRNA Localization and Local Translation in the Growth Cone of Motor Neurons.
Claudia F allini et al. The Journal of Neuroscience. 2016. url: http://www.jneurosci.org/content/36/13/3811

Nuclear speckles are detention centers for transcripts containing expanded CAG repeats.
Martyna Urbanek et al. BBA Molecular Basis of Disease. 2016.
url: https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2016.05.015

【幹細胞研究】
Wnt Ligands Secreted by Subepithelial Mesenchymal Cells Are Essential for the Survival of Intestinal Stem Cells and Gut Homeostasis Valenta et al.
Cell Reports. 2016. url: https://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2016.03.088

Single-cell differences in matrix gene expression do not predict matrix deposition
Cote et al. Nature Communications. 2016. url: https://dx.doi.org/10.1038/ncomms10865

Proteostatic Control of Telomerase Function through TRiC-Mediated Folding of TCAB1
Freund et al. Cell. 2014. url: https://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.10.059

【 Long Non-coding RNA 】
Rapid evolutionary turnover underlies conserved lncRNA–genome interactions.
Quinn et al. Genes & Development. 2016. url: http://genesdev.cshlp.org/content/30/2/191.long

Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins.
Chu et al. Cell. 2015. url: https://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.03.025

【ウイルス・細菌・病原体】
Primary Human Placental Trophoblasts are Permissive for Zika Virus (ZIKV) Replication
Aagaard et al. Scientific Reports. 2017. url: https://www.nature.com/articles/srep41389

Microbiota Diurnal Rhythmicity Programs Host Transcriptome Oscillations
Thaiss et al. Cell. 2016. doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2016.11.003


※このほかにも多数の論文がございます。詳細はお問い合わせいただくか、
   LGC Biosearch Technologies社のCitation Centerをご訪問ください。


ページの先頭に戻る

ご利用ガイド(計測用顕微鏡要件やプロトコルなど)

Stellaris RNA FISHを成功させるためには、顕微鏡・ハードウェア、プロトコルとコントロール、使用する試薬・消耗品を適切に選択し活用する必要があります。

それらをまとめたSTELLARIS RNA FISHご利用ガイドをご用意していますので、
ご活用ください。

   ご利用ガイドPDFのダウンロードをご希望の方は、こちらから。
    (簡単なご登録をお願いいたします)


  ご利用ガイド目次


  顕微鏡要件
 


  • 広視野蛍光顕微鏡
  • 色素に対応する適切なフィルター
  • 60-100x油浸対物レンズ(>1.3 NA)


    こちらの条件が必要となりますので
    ご注意ください。



  プロトコル (日本語)

【STELLARIS RNA FISHでの染色プロトコル】
【STELLARIS RNA FISHと免疫染色の共染色プロトコル】


ページの先頭に戻る

FAQ

  製品の使用

カテゴリ内開閉
  • Stellaris®RNA FISHプローブはDNAを検出できますか?

    Stellaris®RNA FISHプローブはRNAにハイブリダイズします。 二本鎖のゲノムDNAをほどく変性ステップが行われないため、DNAにはアクセスできません。 さらに、一本鎖の短いプローブのTm値は、RNAよりもDNAの方が低いため、相補鎖によって競合されます。 Stellaris®RNA FISHプローブは37℃でRNAとハイブリダイズするよう設計されているため、 DNAをほどくために必要な熱変性ステップでは、プローブはRNAに結合しません。 そのため、異なるプローブタイプを使用したRNAとDNAの同時検出は現在サポートされていません。
  • どのようなコントロールをお勧めしますか?

    Stellaris®RNA FISHにおいて必要とされるコントロールは、実験内容やお客様の実験条件により決定されます。センス配列またはスクランブル配列は、アンチセンスまたはRNAiサイレンシングに有用ですが、Stellaris®RNA FISHでは適切なネガティブコントロールとして機能しません。理想的なネガティブコントロールは、試験する細胞/組織サンプル中では通常発現しないRNAに対する特定のプローブセットです。もしくは異なる生物やお客様のサンプルに含まれない遺伝子、(例えばGFP)からのRNAをターゲットとするプローブセットの使用を検討することもできます。

    適切なコントロール設定に関する詳細については、LGC Biosearch Technologies社 webサイトの以下の記事をお読みください。
    http://blog.biosearchtech.com/five-ways-controls-can-demystify-your-stellaris-rna-fish-experiment

    ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織は、時に重大なRNA分解の影響を受ける場合があります。そのような場合、参照遺伝子からのRNAの検出は、実験技術の検証に役立ちます。一般的に使用される参照遺伝子の1つは、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)です。ヒトおよびマウスのGAPDHを含むコントロールとして使用できるStellaris ShipReadyプローブセット、および他の多くの生物用のDesignReadyプローブセットを提供しています。
  • Stellaris®RNA FISHプローブはDNA、RNA、または非標準ヌクレオチドで構成されていますか?

    Stellaris®RNA FISHプローブはDNAオリゴヌクレオチドで構成されており、各プローブは蛍光色素で標識されています。シンプルな構造と小さなサイズにより、プロテアーゼ処理なしでサンプルの透過処理が可能になります。その結果、Stellaris法は他のFISH法と比較しシンプルであり、また補完的な検出技術(免疫蛍光などの)とより簡単に統合できます。
  • マルチプレックス検出に使用できますか?

    Stellaris®RNA FISHプローブは、複数のターゲットを同時に検出することに利用できます。検出可能なターゲットの数は、利用可能な顕微鏡フィルターによって異なり、各色素のスペクトルを分離できるかによって決定されます。それらのフィルターセットに一致している場合、スペクトルの重なりが最小限の色素を組み合わせることができます。 マルチプレックス試験を開始する前に、各プローブセットのパフォーマンスを個別に確認されることをお勧めします。特定の色素多重化の推奨事項については、LGC Biosearch Technologies社 webサイトのStellaris色素および修飾ページをご覧ください。
  • 市販の褪色防止剤を使用できますか?

    LGC社の色素は、Vectashield®Soft and Hard set、Prolong®Gold、Prolong®Diamond、SlowFade®Diamondなど、市販の多くのマウント剤と互換性があります。 特に、Vectashield Mounting Medium(Vector Labs、カタログ番号H1000)の使用をお勧めします。尚、一部の市販のマウント剤では、サンプルを長期間硬化させる必要があることにご注意ください。これは実験のワークフローには便利かもしれませんが、時間の経過とともに蛍光が自然に低下するため、マウント後すぐにサンプルをイメージングすることをお勧めします。 詳細については、Stellaris色素および修飾ページをご覧ください。
  • 免疫蛍光法と組み合わせることができますか?

    Stellaris®RNA FISHは免疫蛍光(IF)と組み合わせることができますが、一部の抗体はFISH条件に適合しない場合があります。使用される固定方法によっては、RNAとタンパク質の細胞構造と高分子集合体の保存性に影響することがあります。 また、研究対象となるエピトープのアクセシビリティに影響を与える可能性があります。 これまでに下記3つのアプローチ法により、Stellaris®RNA FISHとIFを組み合わせた実験が成功しています。

    1) IF抗体をハイブリダイゼーションおよび/または洗浄バッファーに加えます。
    2) IFを実行した後、サンプルをホルムアルデヒドで再固定し、RNA FISHを実行します。
    3) RNA FISHを実行し、サンプルを再固定してから、IFを実行します。

    Stellaris®RNA FISH法と細胞内の免疫蛍光法を組み合わせたプロトコルの概要は、補足資料の4ページに詳細が記載されています:
    Imaging Individual mRNA Molecules Using Multiple Singly Labeled Probes.
    (2008) Raj, A.; van den Bogaard, P.; Rifkin, S.A.; van Oudenaarden, A.; Tyagi, S. Nature Methods 5(10), 877-9.

    IFとStellaris®RNA FISHを組み合わせた別の論文:
    Visualization of Single mRNAs Reveals Temporal Association of Proteins with microRNA Regulated mRNA.
    (2011) Shih, J.D.; Waks, Z.; Kedersha, N.; Silver, P.A. Nucleic Acids Research 39(17), 7740-9
  • 細胞をNo.1カバースリップに接着する必要があるのはなぜですか?

    個々の転写産物からのシグナルを最適に明瞭にするために、サンプルはレンズにできるだけ近く、均一な平面に適切に配置する必要があります。
    シグナルを検出する距離は、細胞が付着しているカバーガラスの厚さが含まれるため、No.1.5カバースリップなど、より厚いガラス表面を使用すると、感度が低下し、明確なStellaris®RNA FISHシグナルの検出がより困難になります。
  • 相同性の高い遺伝子のRNAを区別できますか?

    LGC Biosearch Technologiesと共同研究者の研究により、相同性の高い遺伝子のRNAをStellaris®RNA FISHによって識別できることが示されています。多くの遺伝子相同性はコーディング領域に存在し、非翻訳領域をターゲットとして使用できる場合、全体的な相同性が高いターゲットであっても、簡単に識別することができます。Stellaris®RNA FISH法でのハイブリダイゼーションの条件下では、標的配列に2つ以上のミスマッチを含むオリゴヌクレオチドは弱くハイブリダイズします。交差反応配列を特定して排除するために、BLASTや複数配列アライメントなどのバイオインフォマティクスのアプローチを適用することをお勧めします。
  • ホールマウントサンプルに使用できますか?

    Stellaris法は、ホールマウントゼブラフィッシュ胚、C.elegans、およびショウジョウバエのほか、培養細胞、凍結組織およびFFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋)組織切片(厚さ4〜20µm)のRNA検出のために採用されています。
    Stellaris Citation Center より、ホールマウントアプリケーションでStellaris®RNA FISHを使用している文献をご覧いただけます。

    ホールマウントサンプルが適切な厚さであれば、Stellaris®RNA FISHはうまく機能する可能性があります。Stellaris®RNA FISHプローブは、平均20nt長のオリゴヌクレオチドで構成されており、長いDNAプローブまたは間接的な検出用のアセンブリよりも組織によく浸透します。ただし、20µmを超える厚い組織切片の場合、Stellaris®RNA FISHプローブは、転写産物を効果的にカウントする能力が無く定性的な結果を提供する場合があります。Stellaris®RNA FISHプローブは、厚い切片の転写産物を視覚化するための十分なシグナルを常に提供できるとは限りません。

    尚、RNA可視化のために高品質なRNAを必要としますが、FFPEサンプルはRNAを分解しやすいため、組織切片を用いる場合は、新鮮な凍結組織の使用を推奨いたします。詳細は以下メーカーブログ内、1. Do not perform Stellaris RNA FISH in FFPE tissue if you have any other option.をご参照ください。

    Oka Y, Sato TN.
    Whole-mount single molecule FISH method for zebrafish embryo.
    Scientific Reports. 2015;5:8571. doi:10.1038/srep08571.

    Ji N, van Oudenaarden
    A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos.
    Wormbook. 2012;13:1-16 doi: 10.1895/wormbook.1.153.1

    Xu H, Sepúlveda LA, Figard L, Sokac AM, Golding I.
    Combining protein and mRNA quantification to decipher transcriptional regulation.
    Nature Methods. 2015;12(8):739-42. Doi10.1038/nmeth.3446
  • プローブセットがDNAではなくRNAに特異的に結合していることを知るにはどうすればよいですか?

    Stellaris®法は変性ステップがないため、二重鎖構造内にDNA結合部位が保持され、ハイブリダイゼーションには使用できません。DNaseを使用した場合と使用しない場合の処理​​を含むアッセイを比較する事より、プローブセットのDNAへのハイブリダイゼーションによるStellarisシグナルへの寄与がないことを明らかにできます。


  蛍光色素と光学

カテゴリ内開閉
  • どの蛍光色素を選択すればよいですか?

    Stellaris®RNA FISHプローブセットの蛍光色素の選択は、使用する顕微鏡で利用可能なバンドパスフィルターセットの仕様に最適なものを選択する必要があります。各色素の具体的な推奨事項と検討事項については、LGC Biosearch Technologies社 webサイトのStellaris色素および修飾ページをご覧くださいませ。

    色素スペクトルをフィルターに合わせる方法の詳細については、こちらのブログをご覧くださいませ。 Imaging Stellaris Assays:Get to Know Microscope

    同様に、実験予定のサンプルタイプの自家蛍光を考慮することも重要です。 組織サンプルの自家蛍光は、緑色の波長でより顕著です。 一例として、フルオレセインは約450 nmを吸収し、約520 nmを放出します。 代わりに、赤色または遠赤色で発光するQuasar®570、670、CALFluor®Red 610色素などの長波長の蛍光色素分子を使用すると、自家蛍光から真の信号を容易に識別できます。さらに、GFPやtdTomatoなどの蛍光タンパク質を発現している可能性のあるトランスジェニック細胞株の使用を計画している場合は、異なる蛍光最大値を持つフルオロフォアを選択する必要があることに注意してください。 また、Chromaのオンラインの色素およびフィルター選択ソフトウェアを使用して選択されることをお勧めします。
  • 共焦点顕微鏡を使用できますか?

    Stellaris®を初めて使用される場合、広視野蛍光顕微鏡の使用をお勧めします。 ただし、より高度な顕微鏡使用者は、Stellaris®RNA FISHのイメージングに共焦点顕微鏡を使用することに成功しています。共焦点顕微鏡は、点照明を使用して、イメージングの焦点面を制限します。 この技術は、焦点が合っていない光を制限しますが、弱い光のイメージングの感度も低下させます。

    個々の転写物の分子を最適に検出するために、60-100x、1.3 NA以上の油浸対物レンズと冷却CCDカメラを備えた広視野蛍光顕微鏡の使用をお勧めします。光源は水銀ランプまたはメタルハライドランプの必要があり(例:ExFo Excite、Prior Lumen 200)、1秒の露出時間から開始することをお勧めします。

    イメージングに関するヒントについては、LGC Biosearch Technologies社のブログ記事をご覧くださいませ。 Imaging Stellaris Assays Part I: Get to Know Your Microscope
  • なぜ自家蛍光によりStellaris®RNA FISHシグナルが不明瞭になりますか?

    多くの細胞および組織タイプは、可視スペクトルの緑色の領域でより顕著に現れる自然な自己蛍光を持っています。Quasar®570/670やCALFluor®Red 610などの長波長蛍光体を使用すると、自家蛍光から真の信号を容易に識別できます。fluorescein(520 nm付近の発光)などの短波長色素からの信号は、自家蛍光のために検出がより困難です。

    一般に、自家蛍光は組織サンプルでより明らかであり、特定の培養細胞種でより顕著になり、可視スペクトルに及ぶ非常に広範囲に発光を示す場合があります。たとえば、リポフスチン体からの蛍光は、360 nm〜650 nmで検出できます。リポフスチン体からの蛍光の多くは核周囲の細胞質にスポット状に観察されます。また単一分子の真のRNAと異なり、わずかに大きく、より明るく、そして広範囲のスペクトルにわたって蛍光を発するため、識別することができます。

    組織で目的のRNAを調べる場合、Stellaris®RNA FISHシグナルと自家蛍光を区別することが特に重要です。これを達成する1つの方法は、2番目の未使用のフィルターで光を収集することです。これにより、標識した蛍光色素分子を特異的に励起した場合にのみ、目的のRNAが存在することを確認できます。 たとえば、プローブにQuasar 670のラベルが付いている場合、647 nm付近でこの色素を励起し、670 nmで蛍光を発します。 未使用のフィルター、たとえば470 nm近くのFITCを使用して、同じ分子をより短い波長で励起しようとすると、同じ場所に蛍光が表示されないはずです。 複数のフィルターを使用して、または色素に対して不適切なフィルターを使用して蛍光を確認した場合、本当のRNA分子ではなく自己蛍光を確認している可能性があります。自家蛍光の出現率と原因に関する詳細については、Nikon Microscopy Uのwebサイトをご覧ください。

    さらに、自家蛍光の程度は、使用する固定方法によって異なります。ホルムアルデヒドはフラビンなどの蛍光酵素補因子を架橋する傾向がありますが、一方、メタノール/酢酸で固定すると、それらを放出してサンプルから洗い流す傾向があります。高温での長時間の固定は、自己蛍光を悪化させる傾向があります。 全体的なバックグラウンド蛍光を評価し、非特異的プローブ結合の寄与を決定するために、プローブのハイブリダイゼーションを受けていない2番目のサンプルを並行してイメージングすることをお勧めします。
  • LGC Biosearch Technologies社のQuasar®670色素は、Cy5色素の代替品としてリストされています。光退色に対してより耐性がありますか?

    いいえ、Quasar®670とCy5はどちらも同様に光退色特性を持ちます。オリジナルのCy5色素と同様に、LGC Biosearch Technologies社のQuasar®670はスルホン化されておらず、Cy5色素と同じインドカルボシアニンに基づいており、ほぼ同じ特性を持っています。蛍光シグナルを保存するために、Vectashield®などの市販の封入剤を用い、より長波長の色素を最初にイメージングすることを推奨します。詳細は、LGC Biosearch Technologies社 webサイトのStellaris色素および修飾ページをご覧ください。


  Stellaris設計

カテゴリ内開閉
  • 提出した配列が48個のプローブ配列を設計するのに十分な長さでない場合、Stellaris®RNA FISH プローブセットに含まれる各オリゴヌクレオチドの収量はどのようになりますか?

    Stellaris®RNA FISH Probeセットに含まれる各オリゴヌクレオチドの最終的な納品量は、設計されたオリゴヌクレオチドの総数によって異なります。セットに含まれるプローブが48個未満の場合、1つ1つのプローブの総量は増加され、5nmolになるように最終的に調整されます。さらに、通常、RNAターゲットを区別するために48個の異なるプローブを用意する必要はなく、1セットのプローブが48個未満でも、単一RNA分子の可視化が可能です。
  • 48個未満のオリゴを含むStellaris®RNA FISHプローブセットを注文すると、結果(およびコスト)はどうなりますか?

    一般に、Stellaris®RNA FISH法は、25以上のプローブ数を使用すると、より良い結果を生成します。デフォルトでは、転写産物が十分に長い場合、ソフトウェアは最大48のプローブを提案します。 48個未満のプローブを注文する場合、Stellaris RNA FISHプローブセットの各オリゴヌクレオチドの量は、最終混合量5 nmolに調整されます。 Stellaris®RNA FISHプローブセットのコストは、プローブセット内の異なるプローブ数に関係なく一律です。
  • Small RNAを検出するStellaris®FISH RNAプローブセットを設計できますか?

    Stellaris Probe Designerソフトウェアは、それぞれ18〜22塩基長の最大48個のオリゴヌクレオチドを含むプローブセットを設計します。

    最大48個のオリゴヌクレオチドプローブセットを設計するためには、少なくとも1Kb(1,000b)の長さのターゲットが必要です。Stellaris技術は600塩基程の短いターゲット配列でも、セット内のプローブ設計数を減らすことにより使用できます。シーケンスが大幅に短い場合、Stellaris法は信頼性の高い単一分子検出を提供する可能性が低くなります。標的が転写部位やカハール体などのクラスター内で見つかった場合は、より短い配列も適している場合があります。

    設計上に課題が考えられる場合、弊社担当部門へご連絡いただき、対象のターゲットがStellaris®RNA FISHで検出できるかどうかご相談くださいませ。
    問い合わせ先:reagents@primetech.co.jp


  出荷と取扱い

カテゴリ内開閉
  • 納期はどれくらいですか?

    納期はご注文後およそ2~3週間程度です。

    Stellaris®RNA FISHプローブセットは凍結乾燥状態で出荷されるため、ドライアイス等は不要です。
    常温便でお届けします。
  • 凍結融解サイクルはオリゴヌクレオチドにどのように影響しますか?

    オリゴヌクレオチドの凍結融解サイクルを最小限にする必要があります。したがって、溶解したプローブミックスは、今後のご実験に必要な回数分をバイアルに分注し、-20°Cまたは-80°Cの暗所で保管することをお勧めします。
    「オリゴヌクレオチド鎖の凍結/融解が繰り返されると、末端リン酸基、塩基、またはオリゴヌクレオチド単位全体が失われるため、サンプルの望ましくない分解が起こる可能性があります。 この観察は、凍結/解凍プロセス中に、オリゴヌクレオチドおよびバッファー成分が溶媒系から分離するという事実に関連しています。結果として、この分離により、同様の分子間引力と結合切断の割合が増加します。」

    MALDI-MSを使用した凍結/解凍プロセス中のオリゴヌクレオチド鎖の分解の分析
    Analytical Chemistry, Volume 72, Number 20, pages 5092 - 5096, 2000
  • プローブを2,3日常温で放置してしまいましたが、使用しても大丈夫ですか?

    乾燥オリゴヌクレオチドは室温で非常に安定しており、短期間で分解する可能性はほとんどありません。 配達後はなるべく早く冷蔵庫に移動することをお勧めします。 高濃度の溶液中のオリゴヌクレオチドは、数日から1週間冷蔵保存できます。 低濃度では、オリゴヌクレオチドは分解を受けやすくなります。 すべての状況において、光退色を防ぐために暗所で保管を推奨します。
  • どのバッファーに再懸濁したらよいですか?

    オリゴヌクレオチド懸濁液については、ヌクレアーゼを含まない水で作られたTEバッファー(10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 8.0)を使用して、ストック溶液と実験に使用する希釈した溶液を調製することをお勧めします。 EDTAは、微生物汚染から保護するのに役立ちます。 実験でEDTAを許容できない場合は、10 mM Tris-Clバッファーを使用できます。 水のみでの懸濁液は、生理学的pHのヌクレアーゼフリー水に限定されるべきですが、推奨されません。 酸性条件は、脱プリンによるオリゴヌクレオチドの分解を引き起こす可能性があります。

    注:蛍光色素は光退色に敏感です。 光への露出を最小限に抑えるために、琥珀色のマイクロチューブを使用するか、チューブをホイルで包むか、透明なチューブを光を通さないボックスに入れることをお勧めします。 作業溶液を作成後、分注して-15°C以下で保存することにより、凍結/解凍サイクルを避けます。
  • 製品を受け取りましたが、バイアルが空に見えます。 オリゴヌクレオチドはどこにありますか?

    オリゴヌクレオチドは乾燥状態で出荷されます。 オリゴはバイアルの底に薄いフィルム状または微小なペレット状に存在する可能性があるため、バイアルの底にオリゴが見えにくい場合があります。 開封時に製品が失われないように、キャップを取り外す前に、バイアルを遠心機にて短時間スピンダウンすることを推奨します。


ページの先頭に戻る

この製品のメーカー

  • LGC Biosearch Technologies
お知らせ
現在お知らせはありません。

コンタクトフォーム

カタログのご請求
価格表のご請求
見積のご依頼
その他製品に関するご質問・ご相談※具体的なお問い合わせ内容をご記入ください。

キーワードから製品を探す

検索

メーカー名や製品のモデル名・型式などから検索することができます。スペースをあけて複数の単語を入力すると、 AND 絞り込み検索となります。