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カスタムマイクロパターニング・プラットフォーム PRIMO

カスタムマイクロパターニング・プラットフォーム PRIMO

容易なマイクロパターニングで細胞をコントロール

Alvéole社製 PRIMOは、複数のタンパク質を定量的にフォトパターニングする革新的な技術により、様々な基質上において細胞微小環境のケミストリーとトポロジーを制御することが可能です。

専用のソフトウェアLeonardとPLPP光活性化試薬を用い、

・基質上の2Dフォトパターニング
・3D微小構造上のフォトパターニング
・マイクロファブリケーション
・フォトリソグラフィ

のために自由にデザインした、2Dおよび3Dのマイクロパターンを迅速に創出します。

特長

PRIMOのバイオエンジニアリングテクノロジーは、非接触かつマスク不要なフォトパターニング技術です。
フォトパターニングモジュールPRIMOと専用ソフトウェアLeonardoを使用して、光重合による細胞培養基質を構築し、マイクロパターニングにより培養基質表面を機能化することができます。

  • 自由にデザインしたマイクロパターンを作成可能
    PRIMO１台で光造形とマイクロパターニングの両方を行うことができます。
  • 高い互換性
    標準的な基質、様々な硬さ・表面構造の細胞培養容器に対応。
  • 比類なきパフォーマンス：
    • グラジエント：256階調の露光強度
      パターニングにおけるタンパク質の密度改変や光造形におけるZ軸方向の高さ変調が可能。
    • マルチプロテイン：3種類（実験条件による）*1
      独自のソフトウェアによりパターニングの重ね合わせが容易。
    • 高解像度：1.2µm (視野内全てのエリア) *2
      対物レンズの倍率を変えることで分解能や照射範囲を調節可能。
    • 高速：20秒 (視野全体の処理) *2


      *1 使用実績のあるタンパク質：
      Fibrinogen-488、Fibrinogen‐647、Fibronectin、GFP、Neutravidin‐488、Neutravidin‐647、PLL‐PEG‐Biotin、Protein A‐647、Streptavidin、一次および二次抗体 等
      1日の実験で10種類以上のタンパク質使用実績あり。

      *2 約500ｘ300µｍ (20倍対物レンズ使用時)


マルチプロテイン
PRIMOにより光パターニングされたPDMS製微小円柱上にあるFibrinogen-A488(緑)とProtein A-A647(赤)


高解像度
PDMS上に作製されたProtein A-488の1.5µm径ドット(ドット間隔1.5µm)の落射蛍光顕微鏡画像

グラジエント
ガラスカバースリップ上に作製されたProtein A-488のグラジエントの落射蛍光顕微鏡画像

   Alvéole: tools for engineering more reliable and reproducible cell microenvironments in vitro
  



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システム構成



No. 構成品 付属区分 備考
1 PRIMO 付属
2 電源ユニット
3 Leonardoソフトウェア
4 PC 別売 (要件)
5 倒立顕微鏡 ※Nikon・Leica・Olympus に対応。
モデルに関してはお問い合わせください。
6 カメラ (要件)
モデルに関してはお問い合わせください。
7 モーター付きXYステージ (要件)
8 光活性化試薬 詳細・ラインナップ

※この他、光活性化試薬 PLPP Gelをご利用の場合は別売のプラズマリアクターが必要です。

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アプリケーション：タンパク質の2D・3Dマイクロパターニング

細胞接着 細胞遊走
   
  異なる形状のfibronectin+fibrinogen-A647(青)パターン上のvimentinノックアウト・マウスの胚性線維芽細胞。 Phalloidin-A555標識actin(赤)、A488結合二次抗体で検出した抗Paxillin抗体(緑)。   Fibronectinの複雑なパターン上のMDCK細胞の位相差画像
       
軸索ガイダンス クライオ電子顕微鏡
   
  Alexa488（緑）で標識されたラミニンのホイール状パターンの中央に配置されたニワトリ脳移植片。

Courtesy of H. Ducuing, R. Moore, Y. Lecomte, P.-O. Strale and V. Studer.		   [左] PRIMOマスクレス・フォトパターニングで行われた、カーボンEMグリッド(200メッシュ・ゴールド・グリッド・バー)上のECMタンパク質マイクロ・パターン。
Scale bar= 50 μm.

[右] PRIMOマスクレス・フォト・パターニングによって創出されたEMグリッド上でrhodamine-fibronectinマイクロパターン上に閉じ込められた上皮性のPtK1細胞。
Scale bar= 10µm.

L. Engel et al., BioRxiv, 2019.

October 15, 2019実施Webinarオンデマンド視聴
       
細胞の閉じ込め ハイドロゲル構造化と機能化
   
  マイクロ・ウェルの両サイドと底面のfibronectinパターンに接着している3つのHepG2肝細胞。Courtesy of C. Stoecklin and V. Viasnoff   COS-7細胞の培養のためのヒドロゲル構造化と機能化の組み合わせ。 Courtesy of A. Pasturel and V. Studer


微小構造上のタンパク質マイクロパターニングのメカニズム
  微小構造上のタンパク質マイクロパターニングのメカニズム


Video Article : JoVE (2019/10月)
 
Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins
『細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞応答を研究するためのマイクロパターニングのためのPRIMOシステムを用いてタンパク質の光誘導分子吸着』

Cristina Melero et.al, JoVE ISSUE 152, DOI: 10.3791/60092

 ※JoVEサイトに遷移します。

日本語  PDF


Webinar :October 15, 2019
  Micropatterning on EM grids, a strategy for improving cell cryo-ET workflow

Speaker: Dr. Leeya Engel, Postdoctoral Research Fellow, Department of Chemical, Engineering Stanford University


Nature Research webcast sponsored by Alvéole and presented by Nature Research Custom Media.


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アプリケーション：マイクロファブリケーション

マイクロファブリケーション マイクロ流体チップ
   
  光硬化性樹脂SU8で作成した5μm間隔で配置される直径5μmの微小円柱。   [上] マイクロ流体チップと赤のステッチ位置のスケッチ(DMDサイズ：4xレンズによる2.5mm×1.3mm)。
チップの最終的な寸法：20mm x 7.6mm

 [下] PDMSの結果。ステッチマークは見えない。
レジストモールドは、４xレンズを用いて製造された。
       
ハイドロゲルの光重合と光分解    
     
  Pasturel et al., 2018    


マイクロファブリケーションのメカニズム (フォトリソグラフィー)     マイクロファブリケーションのメカニズム (フォトリソグラフィー)

Strale et al., app. Note, Nat. Methods, 2018



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PRIMO 関連品・消耗品

  • PLPP 光活性化試薬

    PRIMO専用のPLPP光励起性試薬は、PRIMOから照射されるUV光 (λ=375nm) で活性化されることで、分子ポリマーブラシ層を分解します。用途に合わせ、PLPPとPLPP Gelから選択可能です。

    PLPP PLPP Gel
    パターニング時間
    全領域パターン
    (500 x 300 µm)
    20倍対物レンズ    		 30～40秒
    (ホワイトパターン
     または
     グラジエント)    		 1秒
    (ホワイトパターン)
    4秒
    (グラジエント)
    基質
    ガラス ○ ○
    硬いPDMS (完全に網目状)：
    平面 または 微小構造    		 ○ ○
    柔らかいPDMS：
    平面 または 微小構造    		 ○ ☓
    ポリアクリルアミドゲルへの
    移行 (カバーガラスを使用)    		 ○ ○
    マイクロ流路チップ ○ ☓
    プロトコル
    プラズマクリーニング 必須でない 必須
    PEG SVA ○ ○
    PLL-G-PEG ○ ☓
    対物レンズ 20倍または4倍 20倍のみ

    ラインナップ
    製品名 型式
    PLPP 1mL (1mLx1) PLPP
    PLPP 3mL (1mLx3) PLPP_PremiumKit
    PLPP 11mL (1mLx10+予備1) PLPP_MasterKit
    PLPP Gel 300µL (300µLx1) PLPP-GEL
    PLPP Gel 900µL (300µLx3) PLPP-GEL_PremiumKit
    PLPP Gel 3.3mL (300µLｘ10+予備1) PLPP-GEL_MasterKit


  • PDMSステンシル

    一つの基質上で試薬を節約して実験条件を増やすことができる、PDMS素材のマルチウェル膜です。
    薄く、柔軟性があるので使いやすく、すべての平面上の基質(ガラス、プラスチックまたはPDMS)に容易に配置することができます。




    ラインナップ
    製品名 型式 形状 詳細
    PDMSステンシル
    (Ø4mm円形ウェルx4) 50個/枚    		 PDMS_STENCILS_4 複数のマイクロ・パターニング実験用のPDMS薄層シート、寸法：Ø 20mm、Ø 4mm 円形ウェルx4
    PDMSステンシル
    (3mm角ウェルｘ9) 50個/枚    		 PDMS_STENCILS_9 複数のマイクロ・パターニング実験用のPDMS薄層シート、寸法：20x20 mm、3x3 mm 正方形ウェルx9
    PDMSステンシル
    (カバースリップ洗浄用) 50個/枚    		 PDMS_STENCILS_F カバースリップの洗浄ステップを容易にするために設計されたPDMSシート、寸法：18x18 mm
    PDMSステンシル
    (3mm TEM grids洗浄用) 100個/枚    		 PDMS_STENCILS_E 3mmTEMグリッド上での洗浄ステップを容易にするために設計されたPDMS薄層シート、寸法：8x8 mm、Ø 3.5 mm
    PDMSステンシル
    (Hydrogelアプリケーション用) 25個/枚    		 PDMS_STENCILS_H マイクロリアクターチャンバーを2つ作成可能な、ハイドロゲルアプリケーション用のPDMSシート、寸法：Ø18.5 mm
    ※最少ご注文数：円形ウェル、角ウェル、カバースリップ洗浄用、TEM grids 洗浄用は2枚以上、
       Hydrogelアプリケーション用は4枚以上でのご注文を承ります。
    ※カスタム仕様のPDMSステンシルのご注文も可能です。詳細はお問い合わせください。

  • 分子ポリマーブラシ表面作製用試薬
    マイクロパターニング時の分子ポリマーブラシ表面を作製するための試薬です。

    製品名 型式 詳細
    PLLgPEG 10mg PPL(20)-g[3.5]-PEG(2) g(Lys単位/PEG鎖)=3.0～4.0を持つPEG(2kDa)に融合するPLL(20kDa)
    PEG-SVA 1g PEG-SVA (5kDa) アミン基に融合する5kDaのPEG鎖と
    SVA機能をもつPEG-SVA
    PEG-SVA 5g PEG-SVA (5kDa) WP

  • 分子ポリマーブラシ・コーティング済ディッシュ
    予め分子ポリマーブラシで表面をコーティングされたディッシュです。
    マイクロパターニング時のPLPP添加のステップにすぐに使用できます。
    製品名 型式 詳細
    PRIMO用分子ポリマーブラシ・コーティング済35mmディッシュ (30個入) R2P 予め分子ポリマーブラシでコーティング済の35mmディッシュ

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PRIMO 仕様／PC・周辺機器要件

  • PRIMO 仕様
    本体
    寸法 (L x D x H) 46.2×32.5×7.2cm
    重量 15Kg
    光学パラメータ
    レーザー波長 375nm (+/-5nm)
    スペクトル幅 1.5 nm
    解像度 (20x対物レンズ NA 0.45) 1.2 µm typ. / 1µm min. / 2µm max.
    内部レーザーパワー 70 mW typ. / 85 mW max.
    光学ケースを出るレーザーパワー 7 mW typ. / 10 mW max.
    レーザークラス 3B
    電源
    電圧 12 V continu
    電流 400 mA typ. / 800 mA max.
    電力消費 4.8 W typ. / 9.6 W max.
    アナログ変調 (BNC入力10kΩ、プルダウン抵抗) 0-5 V ＞100 kHz
    動作環境 (屋内使用のみ)
    標高 2000 m以下
    室温 5～40℃
    最大相対湿度 80% max.
    汚染レベル 2


  • PC・周辺機器要件
    顕微鏡ステージ
    µ manager統合 必要
    ポジショニングの正確性 ＜1µm
    カメラ
    µ manager統合 必要
    センサーサイズ 10.6mm×6.4mm以上
    ピクセルサイズ 11µm未満
    PC(推奨)
    OS Windows 7、8 または 10 Professionnal 64-bits
    プロセッサー Intel Xeonプロセッサー E3-1226 v3
    (Quad core  8MBキャッシュ、3.30GHz) または同等
    メモリ 32GB 1600MHz DDR3
    Display PortまたはHDMIポート 1
    USBポート 1
    PCIスロット ご使用の周辺機器に応じて必要
    ハードディスク 500GB SATA 7200rpm 3.5インチ
    DVDプレイヤー 16x DVD+/-RW Player
    ディスプレイ解像度 フルHD (1920x1080)
    ベンチ
    テーブル・サイズ 900mm×900mm程度




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Webinars

Alveole社が実施したWebinarのオンデマンド視聴はこちらから ご利用いただけます。

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References

Facile and Versatile Method for Micropatterning Poly(acrylamide) Hydrogels Using Photocleavable Comonomers
Dimitris Missirlis et al., ACS Appl. Mater. Interfaces 2022, doi. :10.1021/acsami.1c17901
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsami.1c17901

Acto-myosin network geometry defines centrosome position
Ana Joaquina Jimenez et al., Current Biology, 2021
https://www.cell.com/current-biology/fulltext/S0960-9822(21)00002-6

Quantifying Material Properties of Cell Monolayers by Analyzing Integer Topological Defects
Carles Blanch-Mercader et al., PHYS. REV. LETT., 2021
https://journals.aps.org/prl/abstract/10.1103/PhysRevLett.126.028101

A minimalist model to measure interactions between proteins and synaptic vesicles
Eleonora Perego et al., SCIENTIFIC REPORTS, 2020
https://www.nature.com/articles/s41598-020-77887-1

Stress fibres are embedded in a contractile cortical network
Timothée Vignaud et al., NATURE MATERIALS, 2020
https://www.nature.com/articles/s41563-020-00825-z

Human neutrophils swim and phagocytise bacteria
Nicolas Garcia‐Seyda et al., BIOLOGY OF THE CELL, 2020
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/boc.202000084

T-Plastin reinforces membrane protrusions to bridge matrix gaps during cell migration
Damien Garbett et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4818 (2020)
https://www.nature.com/articles/s41467-020-18586-3

Tailoring Common Hydrogels into 3D Cell Culture Templates
Aurélien Pasturel et al., ADVANCED HEALTHCARE MATHERIALS, 2020
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adhm.202000519

Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells
S E Stasiak et al., SCIENCE ADVANCES, 2020
https://advances.sciencemag.org/content/6/32/eaba1149

Coupling Polar Adhesion with Traction, Spring and Torque Forces Allows High Speed Helical Migration of the Protozoan Parasite Toxoplasma
Georgios Pavlou et al., ACS NANO, 2020
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsnano.0c01893

Microfluidic dialysis using photo-patterned hydrogel membranes in PDMS chips
Hoang-Thanh Nguyen et al., LAB ON A CHIP, 2020
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/lc/d0lc00279h#!divAbstract

Biomimetic niches reveal the minimal cues to trigger apical lumen formation in single hepatocytes
Yue Zhang et al., NATURE MATERIALS, 2020
https://www.nature.com/articles/s41563-020-0662-3

Defining the Design Principles of Skin Epidermis Postnatal Growth
Dekoninck et al., 2020, Cell 181, 1–17, doi.: 10.1016/j.cell.2020.03.015
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420302774

Basement membrane ligands initiate distinct signalling networks to direct cell shape
Michael J.Randles et al., Matrix Biology 2020
https://doi.org/10.1016/j.matbio.2020.02.005

Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies
Mauricio Toro-Nahuelpan et al., NATURE METHODS, 2019
https://www.nature.com/articles/s41592-019-0630-5#Abs1

Substrate area confinement is a key determinant of cell velocity in collective migration
Danahe Mohammed et al., NAT PHYS, 2019
https://www.nature.com/articles/s41567-019-0543-3

Traction forces at the cytokinetic ring regulate cell division and polyploidy in the migrating zebrafish epicardium
Marina Uroz et al., NAT MAT, 2019
https://www.nature.com/articles/s41563-019-0381-9

Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies
Leeya Engel et al., J. MICROMECH. MICROENG., 2019
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1361-6439/ab419a

A mechano-signalling network linking microtubules, myosin IIA filaments and integrin-based adhesions
Nisha Bte Mohd Rafiq et al., NATURE MATERIALS, 2019
https://www.nature.com/articles/s41563-019-0371-y

Photoactivatable Hsp47: A Tool to Regulate Collagen Secretion and Assembly
Essak S. Khan et al., ADVANCED SCIENCE, 2019
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.201801982

A new approach to design artificial 3D micro-niches with combined chemical, topographical and rheological cues
Celine Stoecklin et al., ADV BIOSYS, 2018
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/adbi.201700237

Altered microtubule dynamics and vesicular transport in mouse and human MeCP2- deficient astrocytes.
Delépine C et al., HUM MOL GENET. 2016
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26604147/

Multiprotein Printing by Light-Induced Molecular Adsorption.
 Strale PO et al., ADV MATER. 2016
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26689426/

※この他にも多数の論文がございます。詳細はお問い合わせください。

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FAQ

  PRIMOによるフォトパターニング

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  • 他のマイクロパターニング技術と比較して、PRIMOを使用したフォトパターニングの利点は何ですか？

    PRIMOソリューションは、実験条件を簡単に最適化するために、研究者が操作を完全に自由に制御できるようにします。 PRIMOを使用すると、あらゆる形状のタンパク質パターンを迅速に生成し、複数のタンパク質(使用するタンパク質とその相互作用に応じて制限なしで最大3つ)を正確に整列または重ね合わせて、基質に吸着するタンパク質の局所密度を制御できます。
  • PRIMOはどのようなアプリケーションに使用できますか？

    以下のアプリケーションに使用可能です。

    • 基質上の2Dフォトパターニング
    • 3D微細構造のフォトパターニング
    • 微細加工(マイクロファブリケーション)
  • PRIMOでタンパク質パターンを作製するのにどれくらい時間を要しますか？

    パターンを生成するための合計時間(設計ステップを除く)は、10∼15分です。 照明時間はさまざまであり、投影されるパターンと使用される対物レンズに合わせて最適化する必要があります。 高分子ポリマー(付着防止剤)のUV照射および分解ステップの後、タンパク質が吸着するまで約5分間待機する必要があります(時間は基質に置かれた濃度によって異なります)。
  • 細胞パターンはどのくらいの期間、安定ですか？

    細胞パターンの安定な期間は、使用する基板や培養する細胞の種類によって異なります。特定の条件下では、細胞は最長で2週間タンパク質パターンに付着することができます。当社の研究開発チームは、定期的に新しいプロトコルを開発し、ユーザーに提供しています。
  • PRIMOを使用して、タンパク質をハイドロゲル上にパターニングすることは可能ですか？

    はじめにPRIMOを使用してタンパク質をスライド上にパターン化し、その後にハイドロゲル上に配置してから除去することをお勧めします。 ハイドロゲル上にタンパク質を光パターン化するUV照射の段階はそれらの物理的特性を変え、したがって最初に決定された実験条件を変えます。
  • スライドは事前にコーティングできますか？

    同じ日にコーティングすることをお勧めします。 しかし、当社のR＆Dチームは定期的にコーティングされたスライドを保持できる特定の基質用の新しいプロトコルを開発しています。
  • なぜ表面処理がフォトパターニングに重要なのですか？

    フォトパターニングは減法技術です。 最初の目的は、分子や細胞の付着を防ぐ高分子ポリマーで基質を覆うことです。 次に、PRIMOを使用して、UVと光活性化試薬(PLPP)を組み合わせた作用の下で、この高分子ポリマー表面を局所的に分解します。
  • PRIMOは無菌条件下での実験が可能ですか？

    はい、PRIMOで行われる実験は、PRIMOが無菌室に設置されていない場合でも無菌状態で実行できます。 そのような場合、リンスとインキュベーションのすべてのステップをバイオセーフティキャビネット(BSC)で実行し、サンプルを閉じた培養プレートに入れて、PRIMOフォトパターニングデバイスの電動ステージに配置することをお勧めします。
  • PRIMOは3D構造上へのタンパク質のパターニングに使用できますか？

    PRIMOは、平面、曲面、微細構造など、すべての表面のパターン化に使用できます。 たとえば、マイクロウェル壁またはPDMSマイクロピラーにタンパク質をパターン化することができます。
    詳細についてはお問い合わせください。
  • 光活性化PLPP試薬は常にPRIMOで使用する必要がありますか？

    PLPPは、光パターニング中に分子ポリマーブラシの分解反応を加速します(数時間ではなく数秒)。 ただし、SU8レジンまたはNOAを使用した微細加工操作では、PLPPを使用する必要はありません。これらの製品はPRIMO波長(375 nm)で感光性があるためです。
  • 基質上でどのような分子ポリマーブラシ表面処理を用いることができますか？

    PLL-PEGの使用をお勧めします。 表面コーティングの安定性を高めるために、新しいプロトコルを定期的に開発しています。
  • レーザーの被写界深度は？

    20倍の対物レンズを使用することにより、透明基板を通過するレーザーの被写界深度は200µm∼300µmです。
  • パターニングの解像度は？

    解像度は、20倍の対物レンズで約500 x 300µmの視野全体で1.2µmです。
  • パターニングの最大サイズは？

    PRIMOは、サイズ制限無く、必要なすべての画像をパターン化できます。
  • パターニング可能なタンパク質にはどんなものがありますか？

    Fibrinogen-488、Fibrinogen-647、Fibronectin、GFP、Neutravidin-488、Neutravidin-647、PLL-PEG-Biotin、Protein A-647、Streptavidin、一次抗体と二次抗体など、10種類以上のタンパク質を使用しています。
  • PRIMOを使用したタンパク質フォトパターニングには、どのような基質を使用できますか？

    PRIMOは、PDMS、ガラス、プラスチック、NOA、SU8など、すべての標準的な細胞培養基材のパターニングに使用できます。 新しい基質は、社内の研究開発チームによって定期的にテストおよび検証されています。 社内データはリクエストに応じて入手可能です。
  • PRIMOの微細加工にはどのようなフォトレジストを使用できますか？

    375 nmで感光するすべてのフォトレジストは、PRIMOで使用できます。 Alveoleの研究開発チームは、主にSU8フォトレジストを使用しています。


  Cryo-ET用のPRIMOマイクロパターニング

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  • PRIMOを使用してCryo-ET用の細胞サンプルを準備する場合、どのような違いがありますか？

    PRIMOにより、細胞接着を制御できます。したがって、EMグリッド上の希望する場所 (通常はグリッドのメッシュを構成する正方形の中央) にいくつかの細胞を正確に配置することが保証されます。さらに、作成するマイクロパターンのデザインを完全に制御できます。一部のユーザーの研究活動にて示されているように、以下の目的のために細胞の形状、極性、広がりなどを制御できます：

    • メカノバイオロジー研究
    • FIBミリングプロセスを容易にする
    • 再現性があり、より効率的なCryo-ETイメージングの保証
  • PRIMOはすべてのEMグリッドに適合しますか？

    これまでに様々なグリッド材料をテストしてきましたが、PRIMOはカーボンフィルム、SiO2フィルム、メッシュ付きまたはメッシュなしの窒化ケイ素フィルムで作られたグリッドで使用できることが確認できています。マスク不要のマイクロパターニング技術として、すべての典型的なEMグリッドに適合する必要があります。お使いのグリッドモデルが適合するかどうかはお問い合わせください。
  • PRIMOはフィルムを通してマイクロパターニングを実行できますか？

    はい、グリッドフィルムは透明なので、それを通してUVでパターンを作成することができます。メッシュ上でパターンを作成したい場合は、セットアップの電動ステージのグリッド位置が上下逆になっていることを確認してください (対物レンズの側面)。
  • マイクロパターンがEMグリッドメッシュのフレーム内に配置されていることを確認するにはどうすればよいですか？

    このチュートリアルビデオで示されるように、LeonardoフォトパターニングソフトウェアはEMグリッドメッシュを自動的に検出します。次に、マイクロパターンをその中に配置し、サイズ比を調整して完全にフィットさせます。Leonardoソフトウェアは期待される結果のプレビューを表示するので、マイクロパターニングシーケンスを起動する前にいつでも手動で変更を加えることができます。
  • マイクロパターンを作成したEMグリッドを準備するプロセスにはどれくらいかかりますか？

    分子ポリマーブラシ・コーティングのステップからタンパク質のインキュベーションまで、1日あたり5～15個のEMグリッドにマイクロパターンを作成できます。
  • EMグリッドの処理は繊細な手順で、現在プロセスにはさらに処理手順が追加されているようです。そのための解決策はありますか？

    実際、マイクロパターニングプロセスでは更に処理手順が追加されますが、トレーニング期間の後、グリッドに損傷を与えることなくパターニングプロセスを実行できるようになります。さらに、PDMSステンシルを用いることにより、グリッドをカバースリップ (またはそれ以外) に配置し、マイクロパターニングプロセス全体を通して所定の位置に維持して、グリッドの処理手順を減らすことができます。
  • PRIMOでは、EMグリッドにおいてどれくらいのマイクロパターン解像度を達成できますか？

    PRIMOで得られるEMグリッド上の解像度は、ガラス上と同じ1.2μmです。
  • 細胞播種のステップの前に、パターンを作成したグリッドを保存できますか？また、どれくらいの期間ですか？

    はい、タンパク質を吸着する前に、準備したEMグリッドをPBS中で1か月間保存できます。
  • PEGコーティングの厚さはどれくらいですか？

    約5nmです。
  • どのような細胞をTEMグリッド上にマイクロパターン化できますか？

    ガラス上でのマイクロパターニングと同様に、典型的な哺乳類の接着細胞タイプはTEMグリッド上でパターニングできます。これまで、私たちのチームとユーザーは次の細胞タイプで正常にマイクロパターニングできることを確認しています：HeLa細胞、線維芽細胞、上皮細胞、MDCKII、PtK1。
  • 細胞の状態・機能に対するマイクロパターニングの影響はどのようなものですか？

    マイクロパターニングは、細胞接着を制御することにより細胞の機能と行動の調節に影響を与えます。in vitroのより制御されて再現性のある生化学的微小環境において、マイクロパターニングによって、より生理学的に適切な条件で生きた細胞を研究することができます (Thery, Journal of Cell Science, 2010)。
  • Cryo-ETにPRIMOの技術を使用した論文はありますか？

    はい、次の論文をご覧ください。

    • Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies” M. Toro-Nahuelpan et al., Nature Methods, 2019 (Julia Mahamid's lab, EMBL)
    • Extracellular matrix micropatterning technology for whole cell cryogenic electron microscopy studies“ L. Engel et al., JMM, 2019 (Beth Pruitt's lab, Stanford University, UC Santa Barbara)
    • Lattice micropatterning of electron microscopy grids for improved cellular cryo-electron tomography throughput” L. Engel, C. G. Vasquez et al., BioRxiv, 2020 (Alexander Dunn's lab, Stanford University)


  PRIMOモジュール

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  • PRIMOにはどのような種類のレーザーが組み込まれていますか？

    PRIMOには、375 nmで動作するUVレーザーが含まれています。
  • レーザー出力は？

    チューブレンズを出るレーザーの出力は6mW∼8mWです。 対物アウトレットでは、出力は可変であり、目的に依存します。 Nikon S Plan Fluor ELWD 20x / 0.45基準対物レンズを使用した場合、5mW∼6mWの間です。 強度は約29mW /mm2です。
  • PRIMOの寸法と重量は？

    PRIMOユニットの寸法は46.2 x 32.5 x 7.2 cm(長さx幅x高さ)です。
    重量は15 kgで、設置時に提供される基礎(支え)で支えます。


  専用ソフトウェア：Leonardo

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  • LEONARDOソフトウェアにはどのような機能がありますか？

    下記の機能があります。

    • 同じパターンの複製(行と列の設定、および間隔の調整)
    • 連続パターンまたは微細構造の再調整(プレビュー、回転)
    • グラジエントの管理
  • パターンはどのように描画しますか？

    Inkscape®ソフトウェア(AdobeIllustrator®に類似したオープンソースのベクターデザインソフトウェア)を使用してパターンを描画することをお勧めします。このソフトウェアは、ピクセルとミリメートルの両方で図面を作成し、Leonardoソフトウェアで認識されるさまざまな形式で保存します。
  • どのような画像ファイル形式を使用できますか？

    タンパク質パターンに使用される画像ファイル形式は、tif(ピクセル)またはpdf(メトリック)形式である必要があります。


  フォトパターニング・プラットフォームと試薬

カテゴリ内開閉
  • PRIMOを使用するにはどのような機器が必要ですか？

    以下の機器が必要です。

    • 焦点維持システムを備えた倒立顕微鏡：
      ・Nikon Ti-EおよびTi-2
      ・Leica DMi8
      ・Olympus IX83
      ※モデル毎の構成資料をご提供可能です。お問い合わせください。

    • 落射蛍光システム
    • 電動X / Yステージ
    • カメラ
    • コンピュータ
    • プラズマリアクターと専用ポンプ (任意)
  • PRIMOを使用したタンパク質フォトパターニングに必要な消耗品と試薬は？

    下記のものです。

    • PLPP
    • ガラスまたはプラスチックで作られた標準的な細胞培養基質(スライド、カバースリップ、ペトリ皿、3Dデバイスなど)、または高分子ポリマーで前処理された基質
    • 事前に切断されたPDMSステンシル(フリーデザイン)(任意)
    • パラフィルム
    • 先端の細いピンセット
    • マイクロピペットと適切なチップ
    • PLL-PEG 1x溶液 in 10 mM HEPES pH = 7.4(※)
    • 試験タンパク質の溶液、C = 10-100µg/mL
    • PBS 1x溶液、pH = 7.4

    ※前処理されていない基材に分子ポリマーブラシ表面処理を施すことを推奨します。


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