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① myTXTL Pro Kit と myTXTL Antibody/DS Kit の違いは何ですか?
 myTXTL Pro Kitはジスルフィド結合を必要としないタンパク質の発現を目的としています。また弊社の 2 つのキットの中では最も高い収量が得られます。Antibody/DS Kitは、抗体や酵素など、ジスルフィド結合を含むタンパク質の発現を目的としています。Antibody/DS Kitの収量は発現するタンパク質によって異なりますが、deGFP の場合は Pro Kitの収量の約 30 ～ 50% です。なおこの収量はほとんどの下流アプリケーションに十分なタンパク質です。 |
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② myTXTL Pro Kit はジスルフィド結合の形成が可能ですか?
ジスルフィド結合の形成を必要とするタンパク質を扱う作業には、myTXTL Antibody /DS Kitをお勧めします。VHH/ナノボディなどジスルフィド結合が 1 つだけのタンパク質は、myTXTL Pro Kitで発現して活性を示す可能性がありますが、一般的には、ジスルフィド結合を含むタンパク質は、myTXTL Antibody /DS Kitで最も高い収量と最高の活性を示します。 |
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③ 以前は myTXTL Sigma 70、Linear DNA、または T7 Expression Kit を使用していましたが、これらのキットは製造中止になっているようです。今はどのキットを使用すればよいですか?
弊社の 3 つのオリジナル myTXTL Kitは、2024 年 8 月に販売中止になります。myTXTL Pro Kitは、これら3つのキットの特性を 1 つにまとめたキットであり、お客様のニーズを満たすキットです。このキットは、線状DNA とプラスミド DNA およびすべてのE. coliプロモーターをサポートし、T7 RNA ポリメラーゼを発現する Pro Helper Plasmid を追加することで、T7 プロモーターベースの発現も可能にします。すべての Pro Kitには、Pro Helper Plasmid と T7 deGFP Positive Control Plasmid が含まれています。ジスルフィド結合を含むタンパク質の発現に興味がある場合は、myTXTL Antibody /DS Kitが最適です。 |
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④ myTXTL 反応はスケーラブルですか?
はい、myTXTL 反応は 2 ～ 100 μL の容量で実施されます。50 μL 以上の容量で行う場合は、反応混合物の適切な酸素化を可能にするために、振とうするか、表面積と容量の比率が高い反応容器に切り替えることをお勧めします。myTXTL 反応は、溶存酸素の量に非常に敏感です。50 μL を超える容量を使用する場合は、平底 ELISA、ディープ ウェル プレート、または組織培養プレートを使用し、650 RPM で振とうすることをお勧めします。T7 deGFP などのポジティブコントロールプラスミドの 1 つを使用して、これらのセットアップをテストすることをお勧めします。重要なことは、酸素化のバランスを取り、表面積が大きすぎるために反応が乾燥しないようにすることです。反応容量のスケールアップに関する追加のガイダンスについては、キットマニュアルを参照してください。 |
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⑤ myTXTL システムを使用する場合、どのようなプラスミド設計パラメータを考慮する必要がありますか?
myTXTL プラットフォームは E. coli の内因性転写および翻訳機構に依存しているため、機能的な遺伝子カセットには、E. coli RNA ポリメラーゼおよび関連する転写因子 (主に Sigma 70) によって転写されるプロモーター、またはこれらのポリメラーゼがヘルパー プラスミド (ツールキットで入手可能) から発現される場合は T7/T3 RNA ポリメラーゼによって転写されるプロモーターが含まれている必要があります。リボソーム結合部位も E. coli 翻訳機構と互換性がある必要があります。機能的な遺伝子カセットの構築方法に関するより一般的なアドバイスについては、最新の myTXTL ハンドブックを参照してください。 |
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⑥ myTXTL システムではどのプロモーターがサポートされていますか?
myTXTL は、E. coliタンパク質発現で使用されるすべてのプロモーターをサポートします。これには、内因性E. coli転写機構に依存するプロモーターや、T7 などの別の RNA ポリメラーゼを必要とするプロモーターが含まれます。すべてのキットには、T7 RNA ポリメラーゼを発現し、T7 プロモーターからの転写を可能にするヘルパープラスミドが付属しています。E. coli RNA ポリメラーゼによって認識されるプロモーターを使用する場合、このヘルパープラスミドは必要ありません。pET ベクターなどの誘導性プロモーターを含むプラスミドを使用する場合は、反応に誘導剤 IPTG を 1 mM で追加する必要があります。また誘導性プロモーターである場合は、プラスミド濃度を誘導剤の範囲で調べる必要がある場合があります。 |
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⑦ myTXTL キットではどのタイプの DNA/RNA テンプレートがサポートされていますか?
すべての myTXTL キットは、mRNA だけでなく、プラスミドまたは線形 DNA テンプレートもサポートします。 |
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⑧ 私のプラスミドには誘導性プロモーターがありますが、myTXTL と互換性がありますか?
myTXTL は、 E. coliタンパク質発現で使用されるすべてのプロモーターをサポートします。これには、内因性E. coli転写機構に依存するプロモーターや、T7 などの別の RNA ポリメラーゼを必要とするプロモーターが含まれます。誘導性プラスミドでは、最高のタンパク質収量を得るために誘導剤を追加する必要があります。たとえば、pET (T7lac プロモーター) システムでは 1 mM IPTG が必要です。それ以外の場合は、myTXTL 反応における誘導剤とプラスミドの濃度については、次の表のガイダンスに従ってください。
一般的な誘導性プロモーターを使用する場合は、次の誘導剤とプラスミドの濃度をお勧めします。
| Promoter |
Inducer |
Recommended Inducer Concentration in myTXTL |
Units |
Recommended Plasmid Template Concentration in myTXTL |
Units |
| T7lac |
IPTG |
1 |
mM |
10 |
nM |
| TetA |
aTc |
20 |
µg/mL |
20 |
nM |
| araBAD |
L-Arabinose |
2 |
% |
20 |
nM |
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⑨ myTXTL システムではどのような添加物が許容されますか?
myTXTL システムで未知の効果を持つ物質を含むソースから myTXTL システムにコンポーネントを追加する必要がある場合があります。
以下は、パフォーマンスを低下させることなく許容できる化学物質/試薬のガイドです。
1) グリセロールはmyTXTL反応量の0.1%まで許容される。
2) DMSOはmyTXTL反応量の1%まで許容される。
3) EDTAはmyTXTL反応量に対して0.1mMまで許容される。
4) Tris-HCl（pH 8）は、myTXTL反応量の50 mMまで許容される。
5) CaCl2はmyTXTL反応量1mMまで許容される。
6) MgCl2はmyTXTL反応量1mMまで許容される。
7) NaClはmyTXTL反応量の50mMまで許容される。
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⑩ 線状 DNA テンプレートを使用する場合、タンパク質収量に違いはありますか?
はい、線状テンプレートから得られるタンパク質収量は、環状プラスミド バージョンと比較して減少することが予想されます。10 ～ 30% の減少は、Pro Kitの正常範囲内であると考えられます。この減少は、Antibody /DS Kitでは最小限になる傾向があります。 |
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⑪ myTXTL 反応用のプラスミド テンプレートを準備する方法について推奨事項はありますか?
myTXTL には、ヌクレアーゼ (DNase、RNase) や TXTL 機構の阻害剤 (EDTA、エチジウムブロマイド、SDS、Cl- イオン、エタノールなど) を含まない高品質のテンプレート DNA が必要です。標準的な市販キットでプラスミド DNA を調製する場合、通常、サンプルを RNase で処理しますが、下流処理中に完全に除去できない場合があります。そのため、調製した DNA を市販の PCR クリーンアップ キットまたは標準的なフェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿にかけることを強くお勧めします。理想的には、テンプレート DNA は脱イオン化されたヌクレアーゼフリーの水に溶解します。Mg2+ および K+ イオンは転写と翻訳に非常に重要であり、マスターミックスで最適化されているため、追加するとキットのパフォーマンスが低下する可能性があることに注意してください。ZymoPure システム精製キットで調製したプラスミド DNA または市販ベンダーから入手したプラスミド DNA では、通常、この追加の精製手順を省略できます。 PCR で生成された線状テンプレートには、PCR 精製キットのクリーンアップ (または磁気ビーズのクリーンアップ) 手順が 1 回（だけ）必要です。myTXTL 反応に、希釈したPCR反応を添加する場合は、クリーンアップは必要ありません (反応中のグリセロールが 0.1% 以下であることを確認してください)。追加の推奨事項については、キットのマニュアルを参照してください。 |
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⑫ タンパク質生成に使用する場合、myTXTL 反応を実行した後にサンプルを分析するためのオプションは何ですか?
クマシー染色 SDS-PAGE やウェスタンブロット分析などの標準的な生化学的方法とは別に、無細胞タンパク質生産の大きな利点は、精製せずに活性アッセイでタンパク質機能を直接定量および/または分析できるオープンシステム環境です。あるいは、一部の活性アッセイでは、アフィニティ精製による下流処理が必要になる場合があります (アフィニティタグが存在する場合)。SDS-PAGE 分析を選択した場合は、TXTL 反応から直接少量のサンプル (1～3 μL) を採取するか、バックグラウンドシグナルを減らすために、標準プロトコルに従って TCA/アセトンまたは酢酸アンモニウム/メタノールでタンパク質を沈殿させることができます。 |
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⑬ myTXTL 反応をインキュベートするには、インキュベーター、サーモブロック、ウォーターバスのどれがお勧めですか?
反応チューブの蓋に水が結露しないようにすることが非常に重要です。結露すると、myTXTL 反応成分の濃度が大幅に上昇し、パフォーマンスが低下したり、再現不能になったりする可能性があります。インキュベーターとウォーターバス/Lab Armor ビーズで培養するのが最適です。水は空気よりも熱伝導が速く、ウォーターバスは温度変動が少ないため、チューブ全体を囲む一定の温度の密閉環境と組み合わせると、再現性と収量が向上します。myTXTL 反応は、蓋付きの Eppendorf Thermo Mixer でもうまく機能します。 |
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⑭ myTXTL Antibody/DS Kitで IgG を発現させたい場合、別々の DNA テンプレートに重鎖テンプレートと軽鎖テンプレートがある場合、使用すべき比率はどれくらいですか?
プラスミド DNA テンプレートでも線状 DNA テンプレートでも、重鎖テンプレートと軽鎖テンプレートをそれぞれ 5 nM の等モル濃度で使用することをお勧めします。 |
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⑮ キットのコントロールタンパク質の合成には成功しましたが、目的のタンパク質が myTXTL システムで合成されませんでした (または、低収量でしか存在しません)。何かできることはありますか?
はい！タンパク質生産効率に影響を与えるパラメータは次のとおりです。
- DNA 設計 (プロモーターの強度、アフィニティタグの位置、TXTL 要素)
- DNAの純度
- DNA濃度
- 培養温度、時間、容器
- フォールディングヘルパー、シャペロン、酸化剤の存在
したがって、最適化のために評価する必要があります。また、キットの最新の myTXTL マニュアルでこれらのトピックに関する推奨事項も参照してください。 |
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⑯ タンパク質が機能的に活性でなかったり、myTXTL 発現システム内で凝集体を形成したりする場合はどうすればよいでしょうか?
組み換えタンパク質が機能的に活性化するには、重金属イオンや補酵素などの補因子が必要かどうかを検討してください。これらはタンパク質合成中に存在する必要があります。さらに、低濃度のマイルドな洗剤 (Triton-X-100、ドデシルマルトシドナトリウム、CHAPS など) を反応に加えたり、分子シャペロンを加えることもできます。myTXTL システムでは、タンパク質にグリコシル化やリン酸化などの翻訳後修飾を導入できないことに注意してください。インキュベーション温度を下げると、新生ポリペプチド鎖の凝集を防ぎ、適切なタンパク質の折り畳みを促進するのに役立つ場合があります。 |
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⑰ myTXTL Antibody /DS Kitの T7 GLuc ポジティブ コントロール プラスミドから発現されるタンパク質は何ですか?
myTXTL Antibody/DS Kitの陽性コントロール プラスミドは、5 つのジスルフィド結合を持つガウシアルシフェラーゼ Dura タンパク質を発現します。ネガティブコントロール反応と比較すると、精製せずに SDS-PAGE ゲル上で確認できます。その活性は、NanoLight GLuc GLOW アッセイ (NanoLight Technology、カタログ番号 320-50) を使用してアッセイすることも、別売りの GLuc 標準 (NanoLight Technology、カタログ番号 321-100) を使用して定量化することもできます。 |
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⑱ バクテリオファージを再起動するにはどの myTXTL キットを使用すればよいですか?
myTXTL Pro Kitはバクテリオファージの再起動に最適ですが、ファージの再起動には反応ミックスへのいくつかの変更が必要になる場合があります。ファージの再起動に関する詳細な提案については、マニュアルを参照してください。 |
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⑲ myTXTL でバクテリオファージを再起動するための推奨事項はありますか?
myTXTL Pro Kitのもう 1 つの用途は、ゲノムインプットからバクテリオファージを再起動できることです。いくつかのファージは myTXTL システムで複製されることが示されており、一般に次の変更によってメリットが得られます。
- 追加の dNTP (DNA ゲノムの複製用) をそれぞれ 0.3 mM ずつ、PEG 8000 を 0.5～4% 加えると、ファージの最適な生成に役立ちます。これらの成分をゲノム、Pro Master Mix 9 μL、必要に応じて水と合わせて 12 μL にし、1.5/2 mL チューブにまとめます。反応量が多い場合は、マニュアルに記載されているように大規模反応用に振とうする必要があります。弊社のプロトコルに従って、一晩インキュベートします。
- ファージゲノム濃度がまだ公開されていない場合は、最適化する必要がある場合もあります。T7 では 0.25 nM が適していましたが、T4 では 1 nM が最適でした。これはゲノムの品質に一部依存します。ファージゲノムが非常に高純度で、汚染物質がなく、完全性が高いことが非常に重要です。
- 市販の T7 ファージゲノム DNA は、陽性コントロールとして Pro Master Mix で直接使用できます (BocaScientific の DNA を使用しました: https://bocascientific.com/310000-86-detail)。
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⑳ myTXTL キットのポジティブコントロールプラスミドからタンパク質を合成できないのはなぜですか?
次の可能性が考えられます。
- 不適切な保管によるマスター ミックスの不活性化。
myTXTL マスターミックスは -80°C で保管する必要があり、凍結融解サイクルの回数は最小限に抑える必要があります。
- 反応の設定が不適切。
現在の myTXTL マニュアルで myTXTL 反応を設定するための推奨事項を確認してください。
- myTXTL 反応のヌクレアーゼによる汚染。
ヌクレアーゼによる汚染を避けるため、手袋を着用し、ヌクレアーゼを含まない水、滅菌済みのチップとチューブを使用してください。myTXTL 反応のセットアップには、脱イオン化されたヌクレアーゼを含まない「Molecular Grade」の水を使用してください。
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㉑ プラスミド DNA バッチに応じて異なるタンパク質収量が観察されるのはなぜですか?
バッチ間の変動により、プラスミド溶液中に存在する TXTL 阻害剤汚染のレベルが変化する可能性があります。最新の myTXTL マニュアルに記載されている、TXTL 反応用のテンプレート プラスミド DNA を準備する方法についての推奨事項に従ってください。 |
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㉒ 直鎖DNAテンプレートはどのように準備すればよいですか？また、直鎖DNAテンプレートのデザイン上の推奨事項は何ですか？
PCR 産物は、反応中の最終グリセロール濃度が 0.1% 以下であり、PCR 反応で平均して必要なタンパク質収量を促進するのに十分な線状 DNA が生成されている限り、無細胞発現の DNA テンプレートとして直接使用できます。既知の固定したテンプレート濃度が望ましい場合は、PCR 産物を標準的な PCR クリーンアップ手順にかけ、分子生物学グレードのヌクレアーゼフリー水で最終溶出する必要があります。これにより、反応あたりのタンパク質収量がわずかに増加することもあります。線状 DNA は、いくつかの市販 DNA サプライヤーから注文して、myTXTL で直接使用することもできます。線状 DNA テンプレートの設計要件に関する情報については、該当する myTXTL マニュアルおよび IDT のアプリケーション ノートを参照するか、特定のシーケンス推奨事項に関する質問については reagents@primetech.co.jp にお問い合わせください。 |
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㉓ myTXTL キットを誤って室温または 4°C で保管してしまいました。それでも使用できますか?
残念ながら、これによりパフォーマンスが大幅に低下したり、機能が失われる場合があります。最高のキットパフォーマンスを確保するには、myTXTL キット マスターミックスを -80 °C で保管し、使用後はできるだけ早く凍結してください。 |
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㉔ タンパク質を発現させたいのですが、DNA設計についてサポートを必要としています。myTXTL で適切に機能する5' および 3' 領域 (プロモーター、RBS、ターミネーター) はありますか?
弊社は、キットプラスミドコントロールを含む、myTXTL で適切に動作することがテスト済みのプラスミドおよび線状 DNA 配列を共有し、ユーザーがアプリケーションに最適な発現を可能にする 5' および 3' 配列に関して設計を最適化できるようにします。ご質問がある場合は、reagents@primetech.co.jp までお問い合わせください。 |
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㉕ myTXTL システムを使用して、大腸菌用にコドン最適化されていない真核生物由来の遺伝子を発現することは可能ですか?
はい。myTXTL マスターミックスには、真核生物タンパク質の発現を可能にするために大腸菌ではほとんど使用されない 7 つのコドンの tRNA が含まれています。 |
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㉖ プラスミド DNA テンプレートではなく、線状 DNA テンプレートを使用する利点は何ですか?
線形 DNA テンプレートを使用すると、クローニング、形質転換、精製などの面倒な手順が不要になるため、設計、構築、テスト、学習サイクルの速度が大幅に向上します。これは、研究および検証が必要な単一のタンパク質の多数の変異体を扱う場合に特に便利です。コストが削減されるため、プラスミド形式と比較して、タンパク質設計のためのサンプル配列スペースも拡張できます。 |
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㉗ 増強型（Enhanced）緑色蛍光タンパク質（eGFP）とdeGFPの違いは何ですか？
deGFP は、レポーター eGFP の N 末端と C 末端が切断されたバージョンであり、無細胞システムでより翻訳可能です。deGFP と eGFP の励起および発光スペクトルと蛍光特性は同一であるため、市販の eGFP タンパク質を標準曲線に使用して、反応中の deGFP を定量化できます。 |
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㉘ myTXTL マスターミックスを解凍して遠心分離した後、チューブの底に小さなペレットがあります。これは正常ですか?
はい。製造工程上、小さなペレットが見える場合があります。このペレットを myTXTL マスターミックスに完全に再懸濁してから分注し、myTXTL 反応をセットアップすることが重要です。 |
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㉙ インキュベーションが完了した後、myTXTL反応液を凍結できますか?
サンプルの取り扱いと保管は、主に対象分子（タンパク質、DNA、RNA）の安定性によって決まるため、最適な条件を評価する必要がある場合があります。ただし、サンプルの完全性を確保するには、インキュベーションを実行した直後に myTXTL 反応液を処理するか、≤ -20 °C で保管することをお勧めします。 |
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㉚ myTXTL マスター ミックスの凍結と解凍により、製品のパフォーマンスが低下すると考えられますか?
凍結融解サイクルの回数をできるだけ制限してください。弊社の研究では、液体窒素で急速凍結し、その後 -80℃ で保存した場合、最大 5 回の凍結融解サイクルでは、myTXTL マスターミックスのタンパク質生成効率に悪影響がないことがわかっています。 |
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㉛ deGFP/eGFP 定量化のための蛍光リーダーの設定に関して何か推奨事項はありますか?
最も重要なのは、励起波長と発光波長が deGFP/eGFP の蛍光特性と一致する必要があることです (例: λEm 488 nm、λEx 535 nm)。読み取りモード、積分時間、ゲイン値などのその他のリーダー設定は、ウェル間の蛍光読み取り再現性の高さを考慮して選択する必要があります。 |