卓越した分解能で空間ゲノミクス分野の新たな次元を開拓する
MERSCOPE™は、シングルセルレベルの解像度と空間ゲノミクス解析を組み合わせた、業界初のハイマルチプレックス、高解像度 in situ プラットフォームです。
MERFISH (multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) 技術により、個々の細胞における RNA の空間的分布を、下流のシーケンス解析を必要とせずに直接マッピング・定量化します。
従来のシングルセルシーケンス解析では失われる、三次元組織内の豊富な空間情報を、組織レベルからシングルセルレベルまでの解像度で検出することができます。
特長
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原理
MERFISH技術は、ハーバード大学 Xiaowei Zhuang 博士の研究室で開発された、空間分解シングルセル・トランスクリプトームプロファイリング技術です *。単一分子FISH (smFISH) の機能を拡張し、ラベリングの組み合わせ、連続的なイメージング、エラーロバスト (エラーに対する頑健性が高い) なバーコーディングを用いて、ミクロン以下の解像度でRNAを検出します。
MERFISH測定では、各遺伝子に固有のバイナリ・バーコードを割り当て、smFISHの連続したラウンドを使用してバーコードを光学的に検出します。各イメージングラウンドにおいて、対応するビット位置に1を含むバーコードを割り当てられた遺伝子はsmFISHとして現れ、0ビットを含むバーコードを割り当てられた遺伝子は暗いままとなります。このsmFISHスポットのパターンにより、数百から数千の転写産物を空間的に分解することができます。
万が一、バックグラウンドの蛍光が読み取りエラーを起こした場合でも、システムは簡単に最も近い正しいバーコードに読み取り値を割り当てることができます。このシステムのエラー訂正型バーコーディングとラベリングの組み合わせにより、転写産物の最高の検出精度が保証されます。
これにより、研究者はすべての細胞内のトランスクリプトームの細胞内局在を見ることができるようになります。
* Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. Chen KH, Boettiger AN, Moffitt JR, Wang S, Zhuang X. 2015;348(6233):aaa6090-aaa6090
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ワークフロー
- 遺伝子パネルの設計・注文
カスタマイズパネル構築用ソフトウェアMERSCOPE Gene Panel Design SoftwareがMERFISH 測定に最適なパフォーマンスの遺伝子パネルについて提案を行い、直感的な操作でMERSCOPE 遺伝子パネルを設計することができます。注文されたMERSCOPE 遺伝子パネルはすぐに使用できるフォーマットでお届けします。遺伝子パネルが確定すると、ユーザーはパネル固有の MERSCOPE コードブックを MERSCOPE 装置にダウンロードすることができるようになります。 - サンプル調製
MERSCOPEスライドとVizgenキットを使用し、サンプルを調製します。 - 装置へのロード
MERSCOPE スライドを MERSCOPE フローチャンバーにセットし、MERSCOPE イメージングカートリッジと共に装置にロードします。
- 装置の実行
MERSCOPEスライドに関心領域を定義し、装置をスタートします。高解像度画像取得とデータ処理が自動的に行われます。 - データ出力
データ可視化・解析用ソフトウェアであるMERSCOPE Instrument Software (MERSCOPE Analysis Computerに含まれる) が生画像を自動的に処理し、空間ゲノミクス測定値をすぐにダウンストリーム解析に使用できる形式で出力します。
- 検出可能な転写産物のリスト (.CSV)
- モザイク画像 (.TIFF)
- 細胞マトリックスごとの転写産物 (.CSV)
- 細胞メタデータ (.CSV)
- 細胞境界 (.HDF5) - 可視化・解析
MERSCOPE Vizualizerによりデータを可視化、解析します。
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アプリケーション
MERFISHは、シングルセルゲノミクスにおける画期的な技術であり、基礎科学から創薬、臨床病理学まで、基礎生物学と医学の両分野で幅広く応用されています。MERFISH は、細胞本来の状態を保ちながら幅広い存在量の RNA を定量できるため、培養中の個々の細胞や複雑な組織の in situ トランスクリプトーム解析の多くのアプリケーションを可能にします。
アプリケーション事例  マウス脳受容体のマッピング |
脳内に存在する約370の非感覚的GPCRのうち約90%がシグナル伝達を担い、脳の老化や神経変性疾患において重要な役割を果たしていると考えられていますが、その構造特性、存在量の少なさ、特異性の高い抗体の不足により解析が困難です。
MERFISH Mouse Brain Receptor Mapを開発するために、Vizgenは、標準的な脳細胞型マーカー、非感覚性GPCR、受容体型チロシンキナーゼを含む483個の遺伝子からなるパネルを構築し、マウス脳冠状スライスを用いて、細胞背景とともに脳全体の非感覚性GPCR発現の空間的プロファイルを作成しました。MERFISH測定は、脳の3つの位置の完全冠状切片について、各位置について3つの生物学的replicateを用いて行われ、標的転写産物の正確な位置を決定しました。
Figure 1：MERFISH測定による483の転写産物からの8つのRNAサブセット。
Figure 2：検出された転写産物の数をバルクシーケンシングと比較したところ、強い相関性（r=0.88）が見られ、生物学的replicate間にも強い相関性が見られた。
Figure 3：細胞タイプに依存したGprc5b発現の空間分布。大脳皮質の深部と中部においてGprc5bの高発現のピークが見られる。神経細胞と非神経細胞のシグナルのデコンボリューションにより、大脳皮質中部のピークは神経細胞内の発現が支配的であり、大脳皮質深部のGprc5高発現のピークは非神経細胞内の発現が支配的であることが判明した。このように、MERFISHではシングルセルの分解能で、遺伝子発現の空間的、細胞タイプ依存的な差異をマッピングすることが可能である。
Vizgen社 HCA Poster 2021: MERSCOPE Reveals the Transcriptional Organization of the Mouse Brain より引用
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| 大腸がん細胞と微小環境の新たな空間的関係 |
腫瘍微小環境 (TME) を理解するためには、単に細胞の種類や遺伝子プログラムのカタログだけでは不十分であり、細胞の空間的な構成や、どこで多細胞相互作用ネットワークを形成しているかを見ることが重要です。
この事例では、ヒトのミスマッチ修復機能が低下している MMRd 大腸がん (CRC) と機能が保たれている MMRp 大腸がん標本の、シングルセル空間分解トランスクリプトーム解析を行いました。
腫瘍の変異負荷が高いMMRd腫瘍は、MMRp腫瘍と比較して高い細胞溶解性T細胞浸潤を特徴とする免疫応答を有することが知られており、シングルセルの空間プロファイリングと免疫駆動プログラムがこれらの腫瘍間でいかに異なるかを理解するのに理想的なシステムです。
 | Figure: FFPE結腸癌患者サンプルにおけるMERFISHデータをMERSCOPE Vizualizerで可視化したもの。 データは組織全体 (7A) から個々の細胞 (7D) まで様々な倍率で表示され、細胞のセグメンテーション (黄色) とすべてのRNA転写物の発現が表示されている。
このデータからUMAP※細胞クラスターを生成し (7E)、それらのクラスターを組織上に投影して、各細胞タイプの位置を特定することができる (7F)。 細胞のセグメンテーションを行うために、社内で開発した細胞境界染色をDAPI (data not shown) と組み合わせて使用した。これらの細胞の種類と位置を特定することで、既知および新規の細胞間相互作用が明らかになり、がん細胞と微小環境の関係がより明確になる (7F)。
※UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection、一様多様体近似と投影)
|
がん細胞と腫瘍微小環境のクラスターを、空間的に関連したアルファ近傍に構築した。細胞のクラスターが特定されたら、0.65ミクロンのシェイプを定義して、各クラスターのアルファシェイプを構築した。 互いにその距離内にある細胞を近傍として定義し、統計的に有意かどうかを判断した (8A)。 その結果、がん細胞と微小環境細胞の相互作用やシグナル伝達はランダムではなく、その構成が生物学的に関連していることが示唆された (8B)。
Vizgen社 AACR 2022 Poster : A single-cell spatially resolved map of colorectal cancer identifies novel spatial relationships between cancer cells and the microenvironment より引用
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| ヒト大腸がんの腫瘍微小環境における免疫細胞のマッピング |
ヒトの大腸がんの腫瘍微小環境において、417遺伝子のプロファイリングを行いました。 左の図は、この417種類の遺伝子のうち、10種類のRNAサブセットの空間分布を表しています。
このTranscriptの情報から、細胞クラスタリング解析を行った結果、B細胞、CD8 positive T細胞、NK細胞、マクロファージといった、組織内で転写的に異なる細胞タイプを同定することが出来ました。
中央の拡大図において、青いドットはSOX9+の腫瘍細胞群、この腫瘍細胞群に囲まれた緑色のドットはSPP1発現ストローマ細胞を示しています。赤いドットは免疫グロブリンα1発現で示される、B細胞の大きな集団です。個々の細胞に焦点を当て、その細胞に発現している遺伝子をヒートマップ表示させることも可能です。
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| 神経膠腫と微小環境の細胞間相互作用の解析 |
この研究では、微小環境下における神経膠芽腫、特にグリオブラストーマ細胞と免疫細胞の相互作用を調査しました。筆者らは、MERFISHを利用して、マクロファージが濃縮されている可能性が高い腫瘍サンプルの領域で、135種類の遺伝子プロファイルを解析しました。
ヒートマップは、ヒトのグリオブラストーマ組織切片における、遺伝子のプロファイリング結果です。RNAseqとMERFISHのプロファイリングで、両者の間には相関係数0.82の、高い相関性が見られました。
さらに、間葉系ライクな神経膠芽腫の周辺において、マクロファージが特異的に濃縮されていることを発見しました。右上の図は、間葉系ライクな神経膠芽腫を中心としたときに、その近傍にある最も近い30個の細胞の中に含まれるマクロファージの平均数を表したヒストグラムです。ランダムに予想される分布を黒のバーで、実際に観測された平均値を赤線で示しています。Tissue #1、Tissue #2いずれも、黒の分布のピークよりも右側に実際の観測平均値が位置しており、間葉系ライクな神経膠芽腫の周辺には、マクロファージが有意に多く存在していることが示されました。
一方で、オリゴデンドロサイトで行った同様の解析 (右下) では、マクロファージの有意な濃縮・局在は見られないことが示されました。その後、筆者らは、マウスモデルで実験を続け、マクロファージがin vitroおよびin vivoで間葉系ライクな神経膠芽腫の状態を誘導することを実証しています。
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Webinarオンデマンド
In situ single-cell transcriptomic imaging in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues with MERSCOPE ／ MERSCOPEを使用したホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織におけるinsitu単一細胞トランスクリプトームイメージング
2022/3/31実施(約47分、英語)
※上記画像をクリックいただくと、labrootsサイトが開きます。アカウントをお持ちで無い場合はご登録いただくと視聴可能です。
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試薬・消耗品
| 製品名 | 型式 | 詳細 |
| MERSCOPE スライドボックス (20サンプル /組織・浮遊細胞用) | 10500001 | Vizgenサンプル調製プロトコルを可能にするために、組織サンプル・浮遊細胞用に機能化されたMERSCOPEプラットフォーム用サンプルスライドです。 |
| MERSCOPE スライドボックス (ビーズ無し/20サンプル /接着細胞用) | 10500002 | Vizgenサンプル調製プロトコルを可能にするために接着細胞用に機能化されたMERSCOPEプラットフォーム用サンプルスライドです。 |
| MERSCOPE 140遺伝子パネル | 10400001 | エンコーディングプローブで構成されたカスタム遺伝子パネルです。140遺伝子用。 |
| MERSCOPE 300遺伝子パネル | 10400002 | エンコーディングプローブで構成されたカスタム遺伝子パネルです。300遺伝子用。 |
| MERSCOPE 500遺伝子パネル | 10400003 | エンコーディングプローブで構成されたカスタム遺伝子パネルです。500遺伝子用。 |
| MERSCOPE 140遺伝子イメージングキット | 10400004 | MERSCOPEプラットフォームで測定を行うための試薬とカートリッジがセットになったイメージング試薬キットです。140遺伝子用。 |
| MERSCOPE 300遺伝子イメージングキット | 10400005 | MERSCOPEプラットフォームで測定を行うための試薬とカートリッジがセットになったイメージング試薬キットです。300遺伝子用。 |
| MERSCOPE 500遺伝子イメージングキット | 10400006 | MERSCOPEプラットフォームで測定を行うための試薬とカートリッジがセットになったイメージング試薬キットです。500遺伝子用。 |
| MERSCOPE 細胞境界染色キット (20サンプル) | 10400009 | 高密度組織における細胞分割のための3タンパク質染色試薬が含まれたキット。ヒトおよびマウスサンプルに対応。 |
| MERSCOPE サンプル調製キット※ | 10400012 | 20サンプル分のサンプル調製用試薬が入ったキット。固定または新鮮凍結組織、培養細胞に対応します。
* 構成品の中に医薬用外劇物(冷蔵保管)を含む。 |
| MERSCOPE サンプル検証キット(5サンプル/ヒト) | 10400007 | サンプル調製後の RNA 品質がMERSCOPE 装置での MERFISH イメージング品質に適しているかどうかを検証するためのキットです。smFISHプローブとイメージング試薬がセットになっています。ヒト用。 |
| MERSCOPE サンプル検証キット(5サンプル/マウス) | 10400008 | サンプル調製後の RNA 品質がMERSCOPE 装置での MERFISH イメージング品質に適しているかどうかを検証するためのキットです。smFISHプローブとイメージング試薬がセットになっています。マウス用。 |
※FFPEサンプル用の調製キットは2022年8月に発売予定です (2022年6月現在)。
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仕様
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References
Spatial transcriptomic reconstruction of the mouse olfactory glomerular map suggests principles of odor processing (
)I-Hao Wang et al., NATURE NEUROSCIENCE 25, pages484–492 (2022)
Comparative analysis of MERFISH spatial transcriptomics with bulk and single-cell RNA sequencing ()Jonathan Liu et al., BIORXIV DOI:10.1101/2022.03.04.483068
Using MERSCOPE to Generate a Cell Atlas of the Mouse Brain that Includes Lowly Expressed Genes ()George Emanuel & Jiang He, MICROSCOPY TODAY (2021)
Advances in spatial transcriptomic data analysis ()Ruben Dries et al., GENOME RESEARCH 2021 Oct; 31(10): 1706–1718.
Cell segmentation in imaging-based spatial transcriptomics ()Viktor Petukhov et al., NATURE BIOTECHNOLOGY (2021)
Enables Mapping of Cellular Diversity with Spatial Context at Subcellular Resolution ()George Emanuel and Jiang He, MICROSCOPY TODAY (2021)
Spatially resolved cell atlas of the mouse primary motor cortex by MERFISH ()Meng Zhang et al., NATURE VOLUME 598, PAGES137–143 (2021)
GABA-receptive microglia selectively sculpt developing inhibitory circuits ()Emilia Favuzzi et al., CELL (2021)
Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals fetal liver hematopoietic stem cell niche architecture ()Yanfang Lu et al., CELL DISCOVERY 7, 47 (2021)
Multi scale diffeomorphic metric mapping of spatial transcriptomics datasets ()Michael I. Miller et al., CVPR (2021)
Cell segmentation-free inference of cell types from in situ transcriptomics data ()Jeongbin Park et al., NATURE COMMUNICATIONS 12, 3545 (2021)
Interactions between cancer cells and immune cells drive transitions to mesenchymal-like states in glioblastoma ()Toshiro Hara et al., CANCER CELL (2021)
Spatial organization of the transcriptome in individual neurons ()Guiping Wang et al., BIORXIV DOI:10.1101/2020.12.07.414060 (2020)
Genome-Scale Imaging of the 3D Organization and Transcriptional Activity of Chromatin ()
Jun-Han Su et al., CELL 182(6):1641-1659.E26 (2020)
Molecular, spatial and projection diversity of neurons in primary motor cortex revealed by in situ single-cell transcriptomics ()Meng Zhang et al., BIORXIV DOI:10.1101/2020.06.04.105700 (2020)
Multiplexed imaging of nucleome architectures in single cells of mammalian tissue ()Miao Liu et al., NATURE COMMUNICATIONS 11, 2907 (2020)
Imaging-based pooled CRISPR screening reveals regulators of lncRNA localization ()Chong Wang et al., PNAS 116 (22) 10842-10851 (2019)
Mammalian gene expression variability is explained by underlying cell state ()Robert Foreman, Roy Wollman, MOL SYST BIOL (2020)16:E9146
Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression ()Chenglong Xia et al., PNAS 116, 19490-19499 (2019)
Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification ()Chenglong Xia et al., SCIENTIFIC REPORTS 9, 7721 (2019)
Molecular, spatial, and functional single-cell profiling of the hypothalamic preoptic region ()Jeffrey R. Moffitt et al., SCIENCE 362, 6416-EAAU5324 (2018)
Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy ()Guiping Wang et al.,SCIENTIFIC REPORTS 8, 4847 (2018)
High-Throughput, Image-Based Screening of Genetic Variant Libraries ()George Emanuel et al., NATURE METHODS 14, 1159-1162 (2017)
High-Performance Multiplexed Fluorescence in situ Hybridization in Culture and Tissue with Matrix Imprinting and Clearing ()Jeffrey R. Moffitt et al., PNAS 113, 14456-14461 (2016)
High-Throughput Single-Cell Gene-Expression Profiling with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization ()Jeffrey R. Moffitt et al., PNAS 113, 11046-11051 (2016)
RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization (MERFISH) ()J.R.Moffitt, X.Zhuang, METHODS IN ENZYMOLOGY 572, 1-49 (2016)
Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells ()Kok Hao Chen et al., SCIENCE 348, AAA6090 (2015)
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