• ５種類のタンパク質品質評価が可能：
  二次構造、 類似性、化学的および熱安定性、凝集、定量
• ラベルフリーの解析
• 広い解析濃度範囲 (0.1 ～ ＞200 mg/mL) により、サンプルの希釈または濃縮不要
• 従来のFTIR分光法と比較して、感度を30X改善
• 自動化システムにより、24または96ウェルでの同時解析が可能
• シンプルなワークフロー：
  専用のプレートに水・バッファ・サンプルを載せ、試験プロトコル選択し、
  スタートボタンを押すだけで自動的に測定を実行
• deltaソフトウェアによる容易なデータ解釈が可能
• 前モデル(AQS³pro)からの改良点：
  ・計測サンプル量を半減
  ・計測時間を短縮
  ・より高い分解能の計測が可能

※データは1mg/mL BSAの測定によるもの。

複雑な製剤バッファー中のモノクローナル抗体の解析

ウシ血清アルブミン (BSA) の熱変性の解析

ヒトIgG1への圧力と化学的環境の影響の解析

リガンドの結合と安定化によるタンパク質の構造変化の検出

市販のリファレンス・スタンダードのバイオシミラー構造⽐較

バイオシミラーの比較と加速安定性の予測

MMS解析後の回収サンプルの再測定

複雑な製剤バッファー中のモノクローナル抗体の解析

ネイティブなモノクローナル抗体(IgG1)は、製剤バッファー(10mM Histidine、245mMのTrehalose、10mM Methionine、0.05%PS-20、pH 5.2)で1、5、10、20、50、100、150mg/mL 希釈系列を調製し、AQS3®proで解析しました。 MMSは、高い再現性と精度で広い濃度範囲にわたってモノクローナル抗体の定量分析を可能にすることが示されました。また、MMSは解析のために濃縮サンプルの希釈を必要とせず、光学的に活性な製剤バッファー成分から全く干渉を受けないこと明らかになりました。 Figure 1：差分吸収スペクトル(diffAU)と直線濃度範囲。 (左) 各濃度のdiffAUのreplicateは、極めて整合しており、測定の卓越した再現性と精度を示している。 (右) タンパク質濃度に対するこの最大diffAUのプロットは、1～150mg/mLの濃度範囲にわたりR2=0.999で直線である。 Figure 2：絶対吸収スペクトル(absAU)と二次微分スペクトル。(左) 濃度のノーマライゼーションとタンパク質置換を計算に取り入れ、diffAUスペクトルからabsAUスペクトルを算出。このabsAUスペクトルと異なる濃度の抗体サンプルの二次微分スペクトルは、それぞれしっかりと整合し、抗体の二次構造は、希釈により変化しないことを示す。 Figure 3：Area of Overlap(AO)と類似性の比較。 5 mg/mLのサンプルreplicatesの平均AOと比較したとき、1-150mg/mLのサンプルは全ての濃度範囲にわたり＞98%の類似性を示す。  Figure 4：高次構造(Higher Order Structure; HOS)の解析。HOS解析(ガウスカーブフィッティング)は、すべてのサンプルが全ての濃度範囲にわたって類似した二次構造を持つことを示す。 ※RedShiftBio Application Note : 2019-03 “Monoclonal Antibody Analysis by Microfluidic Modulation Spectroscopy in a Complex Formulation Buffer (1 to 150 mg/mL)” から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

ウシ血清アルブミン (BSA) の熱変性の解析

異なる濃度（1mg/mL、20mg/mL、100mg/mL）のBSAサンプルは、25～90℃の温度範囲で20分間インキュベートし、MMS解析のために室温に冷却しました。タンパク質差分吸収スペクトルは4 cm-1ステップで約1700～1600cm-1のamide Iバンド全体で自動的に取得し、AQS3delta ソフトウェアを用いて解析しました。すべての測定は室温で行い、すべてのサンプルは希釈、透析または他のサンプル調製なしでネイティブ形状で測定しました。 高感度なMMS解析は、BSAの変性と凝集の発生を明確に示しました。 Figure 1：1mg/mLのBSA変性。温度が増加するに従って、αヘリックス構造（1656cm-1）の損失が観察された。これはタンパク質の変性を示す。また、β構造（1618と1692cm-1）の増加が観察され、これは凝集の発生を示す。これらの二次構造変化は60℃から始まり、80℃でプラトーに達するようであった。 20mg/mL、100mg/mLのサンプルにおいても1mg/mLで観察される結果と類似していたが、100mg/mLの70℃を上回る温度ではサンプルのゲル化が起こったため計測不能であった (data not shown)。 ※RedShiftBio Application Note : 2019-01 “Thermal Denaturation Analysis of Bovine Serum Albumin over Wide Concentration Range by Microfluidic Modulation Spectroscopy” から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

ヒトIgG1への圧力と化学的環境の影響の解析

高い静水圧は、温度または様々なカオトロピック薬剤の作用に対して直交したタンパク質アンフォールディングを引き起こす熱力学的駆動体です。 MMSにおける圧力摂動アプローチは、モノクローナル抗体製品やバイオ医薬品の製剤開発のためのモデル・システムとして、ヒト免疫グロブリンの安定性を研究するのに用いることができます。 この研究において、特定の化学的環境でヒト免疫グロブリンをアンフォールディングさせる圧力が、平行βシート構造の逆平行β構造(アミロイドタンパク質凝集の特徴的指標)への定量的変換を促進することを示しました。   [左] PBSバッファー中の全てのサンプルの赤外線スペクトル。 (A) 絶対吸収スペクトル。 (B) 絶対吸光度の二次微分。 (C) 差分スペクトル       (リファレンス・スペクトル：コントロール)。 (D) AQS3deltaソフトウェアからの高次構造推定値。 [右] n-propanol in PBSバッファー中の全てのサンプルの赤外線スペクトル。 (A) 絶対吸収スペクトル。 (B) 絶対吸光度の二次微分。 (C) 差分スペクトル       (リファレンス・スペクトル：コントロール）。 (D) AQS3deltaソフトウェアからの高次構造推定値。 Figure :  2セットのヒト IgG1サンプル(約4.5mg/mL)をPBSとPBS in n-プロパノール(10%)で調製した。 サンプルは、室温(25℃)でBarocycler 2320EXTを使用して一連の圧力(40、50、60、90 kPSI)に15分間さらし、周囲条件に戻した。追加のサンプルは2分間加熱し(80℃)、周囲環境に戻した。このサンプルは、沈降タンパク質を除去するために、遠心分離した(15000g、10分間)。この上清画分を集め、ブラッドフォードアッセイを使用して濃度を測定した。AQS3proを使用して周囲温度(25℃)でサンプルを測定した。各サンプルは replicate測定を行い、データをAQS3deltaで解析した。 ※グラフ画像をクリックするとより大きなサイズで表示できます。 ※RedShiftBio Poster ”Pressure-perturbation of protein secondary structure coupled with Microfluidic Modulation Spectroscopy –a powerful platform for biopharmaceutical formulations development.”から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

リガンドの結合と安定化によるタンパク質の構造変化の検出

リガンドの結合はタンパク質の機能に影響を与え、しばしば標的タンパク質の構造変化を引き起こします。形態は機能に適合するため、リガンドを結合したタンパク質と結合していないタンパク質の⼆次構造を決定することは、リガンドがタンパク質の機能をどのように変化させるかをより深く理解するために不可⽋です。 本研究では、あるタンパク質を熱ストレスに対して完全に安定化させるリガンドと、中程度に安定化させるリガンドの2種類のリガンドで試験しました。すべてのサンプルは、タンパク質濃度を1mg/mL、DMSO組成を⼀定の0.6%にしてTable1のように調製しました： 1) Apoタンパク質に0.6%のDMSO vehicleを加え、リガンドを結合したサンプルのDMSO量と⼀致させた、2）タンパク質1とリガンド1、3) タンパク質1とリガンド2。 その後、サンプルを室温に置いたコントロール群と、50℃に⼀晩さらしたストレス群に分注しました。⽬に見える微粒⼦があったサンプルは、0.2μmのフィルターでろ過した後、すべてのサンプルをAQS3proで測定しました。 結果として、MMSは、熱ストレスによるタンパク質1の構造変化と、2種類のリガンドによる安定化効果を検出しました。タンパク質1はリガンド1によって熱ストレスに対して完全に安定化されること、また、リガンド2も安定化効果を多少高めるものの、リガンド2の存在下では、加熱による構造変化が依然として観察されました。MMSは感度の⾼い⼆次構造の特性評価ツールであり、リガンド結合アプリケーションに⼆次構造情報を提供することができます。 Table 1: 熱ストレス解析のために調製したサンプル Fig.1：絶対吸光度測定。(左) 熱ストレスがApoタンパク質1の吸収スペクトルに影響を与えるが、リガンド1を結合したサンプルでは熱ストレスの影響を受けていない。これは、リガンド1が熱ストレスからタンパク質を保護していることを⽰す。(右) リガンド2を結合した場合と結合していない場合のApoタンパク質1。リガンド2を結合した場合も結合していない場合も、熱ストレスによってメジャーピークの吸光度が⼤きく減少した。しかし、Apoタンパク質の減少は、リガンド2が存在しないサンプルの方が⼤きく、リガンドが熱ストレスに対してタンパク質を幾分安定化させていることがわかる。 Fig.2： ⼆次微分プロット。リガンド2が存在しない場合も、存在する場合も、1652cm-1の主要なピークが熱ストレスの影響を受ける主要な特徴であり、この特徴は、リガンド1の存在下ではより安定していることを示す。 Fig.3： オーバーラップ領域 (Area of Overlap) と類似性。オーバーラップ領域プロットは、絶対吸収スペクトルのベースライン減算⼆次微分から得た。熱ストレスによって1638cm-1の特徴が増加することを⽰す。 Table 2︓オーバーラップ領域の結果から算出した、Apo+vehicle RTサンプルと⽐較した全サンプルの％類似性。 Fig.4：HOS 類似性。類似性プロットを⽤いて、ガウス曲線のフィッティングにより⾼次構造プロット (Higher Order Structure; HOS) を算出した。(左) HOS棒グラフは、50℃の熱ストレス下において、リガンド1がタンパク質1を安定化させ、α-helixとunordered構造がβ-sheetに変性するのを防ぐことを示す。(右) リガンド2がβ-sheetに変性するα-helixとunordered構造の量を最⼩限に抑えることで凝集プロセスを軽減することを⽰すが、タンパク質1は熱ストレスに対して完全には耐性がなく、観察可能なコンフォメーション変化がある。 ※RedShiftBio Application Note : "Detecting Protein Conformational Change Due to Ligand Binding and Stabilization Using MMS" から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

市販のリファレンス・スタンダードのバイオシミラー構造比較

本研究では、ELISAベースのアッセイキットの社内標準として使用する製品候補を特定することを目的として、MMSにより、13種類の市販BSAサンプルを既知の活性を持つコントロールのリファレンス・スタンダード分子4112305と比較しました。 結果として、MMS測定の極めて⾼い感度と再現性により、<2％のサンプル間の構造的な違いを検出し、ELISA製品に組み込む際に許容できる活性を維持した5種類のBSAバイオシミラーサンプルを特定することに成功しました。 Figure：⾼次構造 (Higher Order Structure; HOS) プロットを、⼩さいながらも有意な差が強調されるようにスケーリングを調整したもの。 MMSによるデルタプロット解析、安定性プロット解析でコントロールと最も類似した構造を示した452、509、467、4224155、BB61570101は、ELISAベースのキットでも許容できる活性を示したが、その他の分子は示さなかった(data not shown)。 unordered構造の寄与がわずかであること、また最も高い程度のαヘリックス構造を⽰していることがELISA製品での最も⾼い活性と⼀致しており、αヘリックス領域がアッセイ活性に不可⽋である可能性を示した。 ※RedShiftBio Application Note : "Biosimilar Structural Comparison of Commercially Sourced Reference Standards by MMS Rapidly Detects Subtle but Critical Differences to Correctly Predict Activity for Use in an ELISA Product" から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

バイオシミラーの⽐較と加速安定性の予測

バイオシミラー分⼦は、承認されて市場に出回っているイノベーター分⼦を構造的に模倣して設計されています。バイオシミラーは、多くの治療薬への患者のアクセスを向上させることで、市場における競争の機会を創出するという点で重要です。遺伝⼦改変で作られたバイオシミラーとそのイノベーター分⼦の間のわずかな構造の違いをも測定する能⼒は、バイオシミラー医薬品の承認を得るために不可⽋です。 本研究では、加速安定性試験に使⽤するために、製剤バッファー中の4組の異なるインスリンバイオシミラーを4℃と30℃で8週間保持しました。MMS解析により、従来の技術では⾒えない⾮常に⼩さな構造変化を検出でき、安定性試験に使⽤できることが示されました。さらに、AQS³deltaソフトウェアによってシンプルな数値出⼒が⽣成され、サンプルを迅速に⽐較・ランク付けして結果を容易に解釈することができました。 Table 1：4組の安定性サンプルについて類似性解析を⾏い、各ペアの4℃サンプルをリファレンスとして⽤いて個別の⽐較を⾏い、30℃サンプルの類似性を計算した。また、各サンプルの濃度をオーバーラップ領域から計算し、既知濃度のスタンダードと⽐較した。 シリーズの各4℃サンプルとそれに関連する30℃のサンプル間で1％未満の差が⾒られた。しかし、すべての差は、 予め測定していたサンプル1aの５replicate間の平均分散0.4 +/- 0.07％ (data not shown) よりも⼤きく、⼩さいながらもこれらの差が有意であることを⽰す。計算したサンプル濃度は、名⽬上の濃度の実験誤差の範囲内であり、最も重要なことには、2つのインキュベーション温度のサンプルペア間で有意な変化はなかった。これは、4種類のサンプルのいずれについても凝集によって物質が失われなかったことを⽰している。 Figure 1：4℃および30℃で8週間保持した、製剤化した⼈⼯インスリンサンプルのペアの⾼次構造 (HOS) プロット。各安定性サンプルペアの間の⼩さくも有意な差を⽰す。各構造タイプのパーセンテージ値は、4組のペアすべてにおいてαヘリックスのHOSへの寄与が4℃と30℃のサンプル間で減少し、4組すべてでβシートの量が4℃と30℃のサンプル間で増加したことを⽰している。 Figure 2：各構造の群についての4℃と30℃の差分グラフ。測定されたわずかな違いのため、Fig.1に⽰される両温度での各⼆次構造タイプのサンプルペア間でのすべての⼆次構造変化を、以下の計算を⽤いて算出し、差分HOSプロットに変換した：((30℃での％構造 – 4℃での％構造) / (4℃での％構造)) x 100。この⽅法により、サンプル間の違いが強調され、温度に対する安定性がより⾼いことを⽰すものと変化の⽅向 (正または負) が強調された。この結果から、これらのサンプルの安定性は、⾼い⽅から3、2、4、1であると予測された。これは、収集した以前の独⾃の安定性データ (not shown) と直接相関していた。 ※RedShiftBio Application Note : "Biosimilar Comparison and Accelerated Stability Predictions Based on <2% Secondary Structure Differences Using Microfluidic Modulation Spectroscopy (MMS)" から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

MMS解析後の回収サンプルの再測定

MMSは、⾼い再現性、⾼い感度、⾮破壊の⼆次構造特性評価技術であり、MMS解析後のサンプルを再回収して、さらなる特性解析に使⽤することが可能です。この事例では、HPLC⽔に5 mg/mLで調製したニワトリ卵⽩リゾチームをMMS解析し、解析後に回収したサンプルを、2つに分注して再測定しました。分注１は、さらなる処理なしでMMS解析を行い (collected)、分注2は、MMS再解析の前に 0.5 mL 10 kDa Pierce™濃縮機で濃縮し、その後MMS解析を行いました (concentrated)。卵白リゾチームの構造がMMS解析、再回収、再濃縮によって影響を受けず、貴重なサンプルを節約して再利⽤できることが実証されました。 Figure：最初の 5mg/mL サンプル、再回収サンプル (Collected)、再濃縮サンプル(Concentrated) の⾼次構造 (HOS) の結果。各サンプルの⼆次構造要素の寄与率を⽰している。再回収および再濃縮の後も⼆次構造に⼤きな変化はなかった。 ※RedShiftBio Application Note : "Microfluidic Modulation Spectroscopy as a Non-Destructive Structural Characterization Technique"から引用 ▲ アプリケーションの先頭へ戻る

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•  Vibrio cholerae's ToxRS bile sensing system
  Nina Gubensäk et al., Elife. 2023 Sep 28:12:e88721. doi: 10.7554/eLife.88721. ( )
•  Cefmetazole sodium as an allosteric effector that regulates the oxygen supply efficiency of adult hemoglobin
  Peilin Shu et al., J Biomol Struct Dyn. 2023 Aug 9:1-15. doi: 10.1080/07391102.2023.2245043. ( )
•  The role of α-sheet structure in amyloidogenesis: characterization and implications
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