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Amp-Seq One

Amp-Seq One

1ステップで実現するハイスループットなターゲットジェノタイピング

Amp-Seq Oneとは、LGC Biosearch Technologies社独自のアンプリコンシーケンス法を用いて、お客様自身がハイスループットにターゲットジェノタイピングを実施できるキットです。
1ステップのシンプルなワークフローと拡張性により、スループットを大幅に向上し、育種プログラムを加速させます。さらに、この手法の堅牢性により、カバレッジの均一性が向上し、さまざまなサンプルタイプや前処理方法と互換性が確保されるため、ワークフローにおけるコストを大幅に削減します。

親子鑑定やゲノム選抜などの用途に使用できます。
キットのご納品前には、メーカーやお客様自身によるパイロット試験を実施します。

特長

  • 1ステップのPCR:1ステップ・120分でターゲット増幅とindexingを同時に実施
  • 作業時間の短縮:ハンズオンタイムが半分となりスループットが2倍に
  • 反応あたり最大5,000マーカーに対応
  • 取り扱いやすい試薬:室温で安定な試薬と便利な乾燥インデックスプレート
  • 独自の高品質パネルデザイン
  • 機器、消耗品、人件費を削減

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アプリケーション

  • ゲノム選抜、親子鑑定
  • マーカー選抜(MAS)、戻し交配(MABC)
  • 品質管理
  • 植物や動物の繁殖
  • その他のハイスループットジェノタイピング

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ワークフロー

  • 1ステップのPCR:1ステップ・120分でターゲット増幅とindexingを同時に実施

    スキーマ
    図1.Amp-Seq Oneのワークフロー

    1. Amp-Seq One試薬と増幅用マスターミックスを混合し、384ウェルプレートに分注
    2. 各ウェルにサンプルDNAを添加
    3. サーマルサイクラーを用いて、1ステージPCR反応を実施(約50分間)
    4. 反応終了後、384ウェルプレートの反応液をプールし、ビーズ精製・定量を行い、シーケンス解析へ

    • 総ワークフロー時間:約2時間
    • プレートには、あらかじめインデックスが準備されています
    • 同一のPCRサイクリング条件を使用することで、ユーザーエラーの影響を最小限にします
    • 自動化も可能なため、手作業を減らすことができます


  • 作業時間の短縮・人件費の削減

    シンプルなワークフローにより、作業時間が半分に短縮され、人件費やヒューマンエラー、消耗品のコストが削減されます。
    表1では、PCRステップが1回になったことによるAmp-Seq Oneの作業時間の短縮を示しています。

    表
    表1. Amp-Seq One(本キット), Original Amp-Seq(自社従来法)、Next fastest targeted GBS method(次に速いtGBS法)のプロトコルパラメータの概要

    • * 標準的な液体ハンドリングプラットフォームでサンプルの調製を開始してから、シーケンシング可能なライブラリが完成するまでの1プレートあたりの処理時間を示します。
    • ** PCR 1プレートからPCR 2プレートへのサンプル移動の有無を示します。

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パフォーマンス

  • マーカー密度 最大5,000マーカーに対応

    Amp-Seq Oneは、1反応あたり5,000マーカーを超える多数のSNPのジェノタイピングに適しています。図2は、トウモロコシの5,200マーカーの高密度パネルで得られた高品質なシーケンスデータを示しています。
    図2
    図2. トウモロコシの5,200マーカーパネルのデータセット
    本パネル全体のジェノタイピングコールレートは99%を超え、リードの97%がリファレンスゲノムにマッピングされ、Amp-Seq Oneと高密度パネルを用いて得られたシーケンス結果が高品質であることが示されました。

  • 取り扱いやすい試薬 Amp-Seqアッセイの室温安定性

    Amp-Seqの室温安定性を検証した実験方法(表2)と結果(図3)を下記に示しました。大豆1000マーカーのパネルで実験を行ったところ、増幅前の4時間、および増幅後の20時間の間室温で試薬を放置した場合でも、マップされたリードの割合は90%を超え、SNP深度の均一性は80%を超え、室温での安定であることが示されました。

    表2
    表2. Amp-Seq 試薬の室温安定性を調べるためのセットアップ


    図3. Amp-Seq 試薬の室温安定性
    SetA: Amp-Seq試薬を増幅前の4時間放置
    SetB: Amp-Seq試薬を増幅前の4時間と増幅後の20時間放置
    SetC: 室温放置なし

  • 独自の高品質パネルデザイン 幅広いパネルサイズ

    Amp-Seqアッセイの堅牢性は、キャノーラ、トウモロコシ、ソルガム、大豆、イチゴ、小麦などの作物のゲノムDNAを用い、異なるサイズのSNPパネルで評価されました。図4は、1,152、1,920、5,000個のSNPからなるトウモロコシパネルのデータを示しています。本アッセイの柔軟性と堅牢性が実証されました。


    図4. 様々なパネルサイズにおけるAmp-Seqアッセイの堅牢性
    トウモロコシB73 DNAを1,152、1,920、5,000のプライマーペアからなるパネルで解析しました。シーケンスデータはそれぞれ平均130.3、131.1、115.7リードにダウンサンプリングされました。全パネルが、検出されたSNPの割合90%およびアンプリコンリードのSNP深度均一性80%という仕様を満たしました。


    さらに、植物や家畜の異なる種・サイズのパネルでシーケンスデータを評価しました。
    表3は、トウモロコシ、大豆、ウシの各パネルサイズのデータを示しています。

    表3
    表3. 4つのAmp-Seq One パネルで得られた高品質シーケンスデータの概要
    典型的なジェノタイピングコールレートは90%以上、またターゲットジェノタイピング率は95%を超え、高品質な結果が得られました。

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ご利用までの流れ

キットの開発にあたり、お客様のサンプルを用いたメーカーによるアッセイ検証試験(パイロット1)および、お客様によるアッセイ検証試験(パイロット2)を実施いたします。

   プロジェクトの
お打ち合わせ
  当社からAmp-seq One説明を行った後に、プロジェクト内容 (マーカー数やサンプル数等)をお伺いします。

  
   パイロット1    1.カスタムパネル設計 (5~15週間)
リファレンスゲノムやターゲット情報をご提出いただき、メーカー独自のソフトウェアを用いて設計を行います。設計後は、お客様に内容をご確認いただき、ご承認頂いたうえで次のステップへ進みます。

2.メーカーによるアッセイ検証試験 (4~6週間)
お客様のサンプル※をメーカーへ送付します。
1で作成したパネルを用いて、メーカーでアッセイ検証試験を行います。
※精製済みDNA、植物 (葉)、バルクサンプル (384サンプル)をご用意いただきます。

3.データ解析
Amp-Seq専用に設計されたBiosearchCaller解析パイプライン※を用いて、メーカーがデータ解析を行い、その結果についてお客様にご説明をいたします。
その後、データを共有し、お客様自身にもデータ解析を実施していただき、KPI (「Amp-Seq One品質評価指標」)が達成されていることをご確認いただけましたら、次のステップへ進みます。

※BiosearchCaller解析パイプラインは、変異を検出するために構築されており、変異検出の高い精度(>98 %)と、多様なサンプルデータにおけるジェノタイピングコールにおける高い一致率(>95 %)を保証します。

  
   パイロット2    1.お客様によるアッセイ検証試験
パイロット1で使用したパネル、試薬およびインデックスプレート(384反応分)をメーカーから送付いたします。お客様のサンプルを用いて、実際にアッセイを行っていただきます。

2.データ解析
Raw Dataをメーカーへ送付し、パイロット1同様にBiosearchCaller解析パイプラインを用いて、データを解析いたします。データをお客様へ共有し、共に評価を行います。
目標とするデータが得られたことをご承認いただけましたら、次のステップへ進みます。

  
   Amp-seq One
導入
  お客様の施設におけるワークフローの立ち上げに向け、下記の導入サポートを行います。

  • 解析パイプラインのインストール
  • オートメーションの設定
  • アッセイで使用する試薬や解析パイプラインのカスタマイズ

導入後は、設計されたキットをご注文いただきます。(384もしくは3,840反応分)
キットには、事前に分注された乾燥済みインデックスプレートとターゲティングオリゴライブラリーを含むキットが付属しています。



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マニュアル・データシート・アプリケーションノート



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この製品のメーカー

  • LGC Biosearch Technologies
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